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应用于基因编辑的核糖核蛋白复合体的构建与活性验证

文献类型： 中文期刊

作者： 高伟欣;黄火清;赵晶;张鑫;杨宁;杨浩萌

作者机构：

关键词： Cas9蛋白; RNP复合体; 大肠杆菌; 活性验证

期刊名称：生物技术通报

ISSN： 1002-5464

年卷期： 2022 年

页码：

收录情况： 北大核心（2020版） ; CSCD（2021-2022年度） ; 科技核心（2021版） ; 农林核心（2020版）

摘要： CRISPR/Cas9基因编辑技术具有操作简单、成本低廉和编辑效率高等优点，已经被广泛应用于动物、植物、微生物的基因编辑研究。在该技术体系中，发挥核酸剪切功能的是Cas9蛋白和guideRNA（gRNA）组装而成的核糖核蛋白复合体，即RNP（ribonucleoprotein）复合体。目前，应用体外组装的RNP复合体直接递送进入受体细胞进行基因编辑的研究越来越多，成为提高编辑效率、降低脱靶率的有效手段。本研究以获得具有高效剪切活性的RNP复合体为试验目的，在大肠杆菌BL21（DE3）中成功表达了Cas9蛋白，并通过His-tag亲和树脂对重组Cas9蛋白进行了纯化；同时，通过T7转录试剂盒对g RNA进行体外转录和纯化，使纯化的Cas9蛋白和gRNA自发组装成RNP复合体，经体外活性检测，RNP复合体具有很好的DNA双链剪切活性；将其与donor DNA共同转化到黑曲霉菌株，成功敲除了目标蛋白，编辑效率达到90%以上。本研究获得的RNP复合体，可以应用于丝状真菌的基因编辑，节约了试验时间与成本，并推动RNP介导的基因编辑技术在更多领域的应用。

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  • 相关文献

[1]稳定表达Cas9 蛋白的HeLa 细胞系的建立. . 2020

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