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TRIM74对流感病毒复制机制影响的研究

文献类型： 中文期刊

作者： 叶苗苗;孙楠;李奇兵;石文军;王波;王广文;姜丽;陈化兰;李呈军

作者机构：

关键词： TRIM74;流感病毒;干扰素

期刊名称：中国预防兽医学报

ISSN： 1008-0589

年卷期： 2023 年 10 期

页码：

收录情况： 北大核心（2020版） ; ; CSCD（2023-2024年度） ; ; 科技核心（2023版） ; ; 农林核心（2020版）

摘要： 为探究三方基序蛋白74(TRIM74)对流感病毒复制的影响,本研究设计并合成靶向TRIM74基因的siRNA,即siTRIM74-331,将其转染A549细胞后,利用荧光定量PCR检测siTRIM74-331对细胞中TRIM74转录水平的干扰效率,利用细胞活力检测试剂盒检测该siRNA对细胞活力的影响.结果表明siTRIM74-331的干扰效率较好且不影响细胞活力.将siTRIM74-331转染A549细胞后感染禽流感病毒(AIV)A/WSN/1933株(WSN),并于感染后24h、48h分别进行噬斑滴定,结果显示干扰TRIM74的表达可抑制流感病毒的复制.利用慢病毒包装系统构建TRIM74过表达细胞系(A549-pLVX-TRIM74)和对照细胞系(A549-pLVX),并经qPCR及western blot鉴定正确后,将WSN株(MOI 0.01)分别感染上述两种细胞,并于感染后24 h、48 h收集细胞上清分别进行噬斑滴定.结果表明,过表达TRIM74能够显著促进流感病毒的复制.将WSN株(MOI 5)分别感染A549细胞和HEK293T细胞后,分别采用qPCR和western blot检测细胞中内源TRIM74的转录及蛋白表达水平,结果表明WSN能够刺激细胞内源TRIM74的转录与表达,推测宿主细胞可能通过增强TRIM74的表达响应流感病毒的感染.为探究TRIM74在宿主细胞天然免疫反应中发挥的作用,将不同剂量的表达质粒pTRIM74-V5转染HEK293T细胞,经western blot确定其能够在细胞中呈剂量依赖性表达后,将上述剂量的pTRIM74-V5与pRL-TK、pIFN-β-Luc报告质粒共转染HEK293T细胞(1组);同时将上述剂量的pTRIM74-V5与pRL-TK、pISRE-Luc报告质粒共转染HEK293T(2组),24 h后感染仙台病毒(SeV),12h后采用双荧光素酶试验检测过表达TRIM74对IFN-β和ISRE启动子活性的影响.结果显示,转染空载体的对照细胞在感染SeV后上述两种启动子的活性均升高,而1组和2组细胞中该两种启动子的活性均极显著下降,且随pTRIM74-V5转染量的升高二者的活性均呈下降趋势.分别将SeV和poly(I:C)刺激TRIM74过表达及干扰其表达的HEK293T细胞,12 h后采用qPCR分别检测各组细胞中IFN-β和ISG56 mRNA的转录水平.结果显示,TRIM74过表达的各组细胞中IFN-β及ISG56mRNA的转录水平均显著高于未刺激的Mock组细胞,且均极显著低于转染空载体的阴性对照细胞;干扰TR1M74表达的各组细胞中IFN-β及ISG56mRNA的转录水平均显著高于未刺激的Mock组细胞,且均极显著或者显著高于转染NC siRNA的阴性对照细胞,表明TRIM74能够负调控细胞中相应干扰素的分泌.本研究结果首次表明TRIM74能够促进流感病毒的复制,并负调控宿主细胞中IFN-β信号通路,该研究丰富了流感病毒与宿主因子间的调控网络,为深入了解TRIM74蛋白的功能奠定了实验基础.

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