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中华蜜蜂GABARAP基因克隆、生物信息学分析及原核表达载体的构建

文献类型： 中文期刊

作者： 于慧敏;吴鹏杰;李南南;谭静;徐书法;武江利

作者机构：

关键词： 中华蜜蜂;GABARAP基因;基因克隆;生物信息学;原核表达

期刊名称：中国畜牧兽医

ISSN： 1671-7236

年卷期： 2022 年 01 期

页码：

收录情况： 北大核心（2020版） ; 科技核心（2021版） ; 农林核心（2020版）

摘要： 【目的】对中华蜜蜂（Apis cerana cerana）中自噬相关蛋白Atg8家族成员γ-氨基丁酸相关受体蛋白（gamma-aminobutyric acid receptor type associated protein,GABARAP）基因进行克隆鉴定和生物信息学分析，并在大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中进行原核表达，以期为后续探究该基因的功能奠定基础。【方法】根据GenBank中西方蜜蜂（Apis mellifera）GABARAP基因序列（登录号：XM＿001120069.5）设计引物，采用巢式PCR对中华蜜蜂GABARAP基因进行扩增、克隆；运用生物信息学软件对其氨基酸序列相似性、二级结构、三级结构进行比对和预测分析；构建GABARAP基因原核表达载体，利用Western blotting对GABARAP蛋白进行鉴定后并用IPTG诱导纯化。【结果】经巢式PCR扩增得到中华蜜蜂GABARAP基因序列；使用在线BLAST工具对氨基酸相似性进行分析显示，中华蜜蜂GABARAP与西方蜜蜂、大蜜蜂、小蜜蜂、欧洲熊蜂、东方熊蜂的氨基酸序列相似性为100%；氨基酸序列系统进化树显示，中华蜜蜂与西方蜜蜂亲缘关系最近，与秀丽隐杆线虫亲缘关系最远。生物信息学分析结果显示，GABARAP基因编码区全长354bp，编码117个氨基酸，蛋白分子质量为13.99ku，理论等电点为9.48;GABARAP蛋白二级结构主要由3个α-螺旋、4个β-折叠和6个多肽结合位点构成，二、三级结构预测结果一致；SDS-PAGE分析结果显示，IPTG诱导的GABARAP蛋白分子质量为35ku;Western blotting鉴定结果证明了His单克隆抗体可以特异性识别GABARAP蛋白。【结论】本研究成功克隆了中华蜜蜂GABARAP基因，获得了GABARAP蛋白并进行了生物信息学分析，为进一步研究GABARAP基因及其蛋白在自噬发生中的作用提供了参考。

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