数字农科院2.0

牛病毒性腹泻病毒链特异性SYBR Green荧光定量PCR方法的建立及应用

文献类型： 中文期刊

作者： 刘存;邓永;梁琳;李金祥;张彦明;崔尚金

作者机构：

关键词： 牛病毒性腹泻病毒;非病毒核苷酸序列标签;荧光定量PCR方法

期刊名称：畜牧兽医学报

ISSN： 0366-6964

年卷期： 2019 年 10 期

页码： 2079-2087

摘要： 为了对牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus, BVDV)复制过程中正、负链RNA进行定量检测,通过生物学软件DNAStar和Primer express 3.0设计BVDV正、负链RNA特异性反转录引物并在其5′端添加非病毒核苷酸标签序列以区分BVDV正、负链RNA.同时设计荧光定量PCR引物与非病毒核苷酸标签序列组成引物对,建立了BVDV链特异性荧光定量RT-PCR(ssRT-qPCR)方法,对其敏感性、重复性、特异性进行评估并利用所建立BVDV ssRT-qPCR对不同接毒剂量下BVDV在细胞内复制过程中正、负链RNA进行定量检测.结果表明,以构建的pMD18T-BV+和pMD18T-BV-质粒为标准品建立的BVDV正链特异性荧光定量RT-PCR方法[ss(+)RT-qPCR]和负链特异性荧光定量RT-PCR方法[ss(-)RT-qPCR]在10~2~10~7拷贝范围内具有良好的线性关系,线性相关系数分别为0.998 1和0.995 3;敏感性试验结果显示,ssRT-qPCR敏感性较好,ss(+)RT-qPCR最低检测下限为10拷贝,ss(-)RT-qPCR最低检测下限为100拷贝.重复性试验结果显示,所建立的ssRT-qPCR批内和批间的变异系数为均小于1%,方法重复性良好.特异性试验显示,所建立的ssRT-qPCR方法与牛副流感病毒3型、牛传染性鼻气管炎病毒、牛呼吸道合胞体病毒等不存在交叉反应,特异性较好.利用建立的ssRT-qPCR对不同感染剂量下细胞内BVDV正、负链RNA进行定量分析,结果显示以10、0.1 MOI剂量接种BVDV于MDBK细胞后,BVDV正、负链RNA变化呈现先升后降再逐渐上升的趋势.以1 MOI剂量感染MDBK细胞,BVDV正、负链RNA的动态变化趋势略有差异,整体呈上升趋势.10、1 MOI接毒剂量接种细胞后,BVDV正、负链RNA在感染后36 h基本维持稳定水平,以0.1 MOI接种细胞后BVDV正、负链RNA在感染后24 h即达到稳定水平.BVDV链特异性检测进一步验证了所建立方法的适用性.该研究建立了BVDV链特异性荧光定量RT-PCR方法并利用该方法对BVDV在细胞内复制过程中正、负链RNA的动态变化过程进行描述,为研究宿主蛋白抗病毒机制、BVDV基因组RNA复制及调控机制等研究提供了研究手段.

分类号： S852.653

  • 相关文献

[1]牛病毒性腹泻病毒SYBR Green荧光定量PCR方法的建立及其应用. 刘存,崔尚金. 2018

[2]牛病毒性腹泻病毒RT-PCR方法的建立. 张康,王丹阳,王旭荣,张凯,张景艳,王磊,李建喜. 2018

[3]牛FOXM1基因特异性siRNA干扰效率的分析. 王超,张淑琴,宋雪莹,王改丽,孙娜,郭利,程世鹏. 2019

[4]牛病毒性腹泻弱毒活疫苗免疫持续期的研究. 张淑琴,郭利,王炜,张亭亭,吴永旺,武华. 2012

[5]牛病毒性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立及应用. 张淑琴,郭利,张亭亭,吴永旺,武华. 2011

[6]牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的多克隆抗体制备及鉴定. 高欲燃,朱远茂,康健,史鸿飞,李娇,任宪刚,冯军科,于作,薛飞. 2011

[7]牛病毒性腹泻弱毒疫苗免疫抗体水平与攻毒保护关系的研究. 张淑琴,郭利,武华. 2012

[8]牛病毒性腹泻病毒E2蛋白单克隆抗体的制备及初步鉴定. 王姝,朱远茂,蔡红,马磊,史鸿飞,吕闯,董秀梅,高欲燃,薛飞. 2013

[9]牛病毒性腹泻弱毒疫苗免疫抗体水平与攻毒保护关系的研究. 张淑琴,郭利,王炜,武华. 2012

[10]应用定量RT-PCR对猪瘟兔化弱毒疫苗的质量评价研究. 韩文,王楠,张兴娟,葛叶,韩秋颖,孙元,李素,仇华吉. 2012

[11]内蒙古牛病毒性腹泻病毒血清学调查. 童钦,吕晓妍,王炜,项键. 2013

[12]牛病毒性腹泻病毒LAMP检测方法的建立与应用. 李家伟,郭利,杨勇,王建科,张淑琴,张加力,程世鹏. 2015

[13]牛病毒性腹泻病毒重组E2蛋白多克隆抗体的制备及鉴定. 高欲燃,朱远茂,史鸿飞,任宪刚,冯军科,于作,薛飞. 2010

[14]牛病毒性腹泻病毒BVDV2/JZ05-2毒株牛感染模型建立. 冯卓,刘艳环,朱言柱,李海涛,钟宏鹏,王坤,张润祥,苗利光. 2013

[15]牛病毒性腹泻病毒Real-timePCR方法的建立及其应用. 张淑琴,谭斌,李鹏,杨勇,孙娜,王凤雪,郭利,温永俊,程世鹏. 2014

[16]牛病毒性腹泻病毒荧光标记单克隆抗体的制备及鉴定. 徐树兰,李少英,赵俊,武华. 2011

[17]牛病毒性腹泻在中国的流行现状分析. 朱礼倩,周艳君,于海,童光志. 2011

[18]牛病毒性腹泻病研究进展及防控建议. 郝宝成,梁剑平,王学红,郭文柱,郭志廷,杨贤鹏. 2013

[19]牛病毒性腹泻病毒BVDV-JL株的分离与鉴定. 张淑琴,郭利,冷雪,张亭亭,吴永旺,武华. 2011

[20]猪源牛病毒性腹泻病毒SD0803株细胞传代研究. 孙春清,邓宇,张宏彪,龙进学,韦祖樟,童光志,袁世山. 2012

作者其他论文 更多>>