数字农科院2.0

梅花鹿激活素A重组蛋白真核表达、纯化及其生物活性的测定

文献类型： 中文期刊

作者： 张宇飞;曹满园;王丽英;赵伟刚;李晓霞;常彤;许保增

作者机构：

关键词： 梅花鹿;激活素A;颗粒细胞;真核表达;蛋白纯化

期刊名称：中国农业科学

ISSN： 0578-1752

年卷期： 2020 年 NULL 卷 5 期

页码： 1058-1070

收录情况： 北大核心（2020版） ; CSCD（2020-2021年度） ; 农林核心（2020版） ; 科技核心（2020版）

摘要： [目的]体外真核表达梅花鹿(Cervus nippon)激活素A重组蛋白并测定其生物活性,为进一步明确激活素A在梅花鹿卵母细胞体外成熟过程中的生理学功能提供基础.[方法]利用RT-PCR技术克隆梅花鹿激活素βA (ActivinβA, ACTBA)亚基基因的cDNA全长序列,同时利用生物信息学对梅花鹿激活素βA的基因特征进行分析.在NCBI数据库下载其他物种激活素βA同源序列,利用Clustalx和MEGA 4软件进行同源比对并构建进化树.构建pcDNA4/ACTBA重组质粒并转染至CHO细胞内,进行目的蛋白的体外表达.采用免疫荧光及Western blot技术对目的蛋白表达情况进行检测,并通过Ni-NTA亲和层析柱对蛋白产物进行纯化.采用Western blot检测了梅花鹿激活素A重组蛋白处理后的猪颗粒细胞中的SMAD2和SMAD3的磷酸化水平.最后采用荧光定量PCR及Western blot检测了梅花鹿激活素A重组蛋白处理后的猪颗粒细胞中类固醇激素合成相关酶的表达量.[结果]克隆得到的梅花鹿ACTBA亚基基因含有1 278 bp的碱基,编码426个氨基酸.同源性比较发现梅花鹿ACTBA基因与牛的ACTBA基因同源性最高达98.4%同源.进化分析表明该基因与同为偶蹄目动物的反刍兽牛和山羊亲缘关系最为接近.经酶切、PCR和测序方法鉴定,成功构建真核表达质粒pcDNA4/ACTBA.免疫荧光显示该质粒在CHO细胞中主要定位在细胞质.Western blot结果显示激活素A的前体蛋白分子量约为58 kD左右.镍亲和层析纯化后的激活素A重组蛋白显著增加SMAD2和SMAD3的磷酸化,表明激活素A可以激活SMAD信号通路.同时成熟的激活素A重组蛋白可以诱导猪颗粒细胞芳香化酶(Aromatase)蛋白表达量上调,类固醇生成急性调节蛋白(steroidogenic acute regulatory protein, StAR)表达量下调,FSH受体基因表达量升高,LH受体基因表达量降低,但胆固醇侧链裂解酶(Cholesterolside-chaincleavageenzyme,CYP11A1orP450scc)及3β-羟基类固醇脱氢酶(3β-Hydroxysteroid dehydrogenase, 3β-HSD)基因表达量不变.结果表明梅花鹿激活素A重组蛋白可以增强FSH对颗粒细胞的生物学作用,也可以减弱LH对颗粒细胞的生物学作用.[结论]成功构建了激活素A蛋白的真核表达载体,并获得了较高纯度的、具有生物学活性的梅花鹿激活素A重组蛋白,为下一步激活素A蛋白的生物学功能和生理学机制研究奠定了基础.

分类号： S825

  • 相关文献

[1]猪IL-21的真核表达及其与CD40L共刺激抗体分泌的活性研究. 杨贝贝,符芳,薛美,冯力,刘平黄. 2019

[2]水牛原代体细胞慢病毒感染体系的建立. 段安琴,陆杏蓉,马小娅,梁莎莎,庞春英,梁贤威,邓廷贤. 2019

[3]日循环高温对蛋鸡卵泡发育的影响. 翟利利,冯京海,张敏红. 2011

[4]花生四烯酸对家禽卵泡颗粒细胞的影响. 金艳梅,张晓庆. 2010

[5]卵巢颗粒细胞凋亡的调控因素. 刘鹏,李向臣,姚雅馨,乔利敏,关伟军,马月辉. 2009

[6]高温诱导蛋鸡氧化损伤及对卵泡发育的影响. 杨晓岚,张敏红,冯京海,翟利利,姜礼文. 2012

[7]miRNA调控哺乳动物卵泡发育和卵母细胞成熟的研究进展. 贺小云,刘秋月,储明星. 2019

[8]FecB突变对绵羊发情表型及格拉夫卵泡颗粒细胞中ESR1和ESR2基因表达的影响. 郭晓飞,王翔宇,张金龙,李义海,储明星,张效生. 2020

[9]Wnt信号通路调控哺乳动物卵泡颗粒细胞生长发育的研究进展. 周祖阳,刘玉芳,储明星. 2023

[10]奶牛卵泡颗粒细胞在卵泡发育中的作用机制. 宋浩然,冯肖艺,张培培,张航,牛一凡,余洲,万鹏程,崔凯,赵学明. 2024

[11]lncRNA-MSTRG.7889.1竞争性结合bta-miR-146a靶向Smad4调控牦牛颗粒细胞的凋亡. 孟朝轶,王运路,姚一龙,席广银,牛家强,索朗斯珠,郭敏,徐业芬. 2024

[12]犬瘟热病毒截短P蛋白的表达及纯化. 李爽,易立,程悦宁,曹智刚,林鹏,程世鹏. 2019

[13]甲型鸭肝炎病毒2A蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备. 胡文,孟春春,李传峰,陈宗艳,梁瑞英,李宁,黄云秀,吴润,刘光清. 2014

[14]牛分枝杆菌融合基因ESAT6-MPB63-HSP65的原核表达及鉴定. 郝辉,侯绍华,丁家波,毛开荣,朱鸿飞. 2009

[15]狂犬病病毒N、G两种蛋白在间接ELISA方法中的应用比较. 王净,史利军,李刚,孙全文,吴淑琴. 2013

[16]一种促进植物根系生长的极细链格孢菌蛋白质分离、纯化和生物功能. 杨秀芬,张明,袁京京,邱德文. 2007

[17]裂谷热病毒Gn蛋白主要抗原区的表达、纯化及抗原性分析. 夏鹏,魏建超,陆莹梅,武专昌,李蓓蓓,刘珂,邵东华,邱亚峰,钟登科. 2015

[18]小麦泛素结合酶TaE2的表达分析及蛋白互作. 尹丽娟,陈阳,刘沛,陈明,李连城,徐兆师,马有志. 2014

[19]猪干扰素-γ基因的表达、纯化及活性分析. 潘晓梅,窦永喜,骆学农,刘琼,张冬峰,岳城,才学鹏. 2009

[20]转基因玉米中植酸酶蛋白免疫亲和纯化体系的建立. 赵倩倩,周晓今,柳小庆,杨文竹,李素贞,刘奇,陈茹梅. 2013

作者其他论文 更多>>