文献类型： 中文期刊
作者： 韩雪;张阿娜;王海燕;辛凤姣;谷天一;王钰璐
作者机构：
关键词： 木聚糖酶;柔性区域;热稳定性;毕赤酵母;理性设计
期刊名称：生物技术通报
ISSN： 1002-5464
年卷期： 2024 年
页码：
收录情况： 北大核心（2023版） ; ; CSCD（2023-2024年度） ; ; 科技核心（2024版） ; ; 农林核心（2020版）
摘要： 【目的】瘤胃真菌Neocallimastix patriciarum GH11家族木聚糖酶CDBFV在饲料、食品等领域具有良好应用前景，提高其热稳定性对其生产应用十分重要。【方法】使用分子动力学模拟、机器学习等策略设计潜在CDBFV热稳定性突变体，在大肠杆菌和毕赤酵母中进行异源表达纯化，测定最适反应条件、比酶活和85℃孵育3 min后相对剩余活力，通过结构分析明确热稳定性提高机制。【结果】位于CDBFV N端基序36GNNS39具有较高柔性，对其改造设计的单突变体N37P和N38V在85℃孵育3 min后，相对活力分别降低至70.3%和55.1%，较野生型（48.7%）提升了21.6%和6.5%；进而，在相对活力提升显著的N37P基础上叠加已报道优势突变体N88G，构建双突变体N37P/N88G，其相对活力达到了73.4%，较野生型提高了24.7%；此外，将N37P/N88G在毕赤酵母中进行了分泌表达，在85℃处理3 min后，相对活力达到了88.8%；结构分析表明，N37P突变的引入使得CDBFV形成了新的氢键相互作用，降低活性位点附近柔性，并干预了糖基化形成，进而提高了热稳定性。【结论】成功得到了高耐热双突变体N37P/N88G，为提高GH11家族木聚糖酶的热稳定性改造提供了新的思路和方法，有望推动CDBFV在饲料工业等高温环境下的广泛应用。
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