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新型鹅星状病毒ORF2蛋白纳米抗体的筛选及鉴定

文献类型： 中文期刊

作者： 王丹;吉艳红;梁世蕊;杨洁;朱启运

作者机构：

关键词： 新型鹅星状病毒;ORF2蛋白;纳米抗体;噬菌体展示技术

期刊名称：中国农业科学

ISSN： 0578-1752

年卷期： 2023 年 24 期

页码：

收录情况： 北大核心（2023版） ; ; CSCD（2023-2024年度） ; ; 科技核心（2024版） ; ; 农林核心（2020版）

摘要： [目的]由新型鹅星状病毒(novel goose astrovirus,nGAstV)引起的雏鹅痛风病对我国养鹅业造成了重大经济损失.通过构建nGAstV纳米抗体(nanobody,Nb)噬菌体展示文库,获得识别nGAstV ORF2蛋白的特异性Nb,可为建立nGAstV抗体检测方法及研究nGAstVORF2蛋白结构和功能奠定基础.[方法]使用蔗糖密度梯度离心方法纯化在LMH细胞中增殖的nGAstV,RT-PCR鉴定nGAstV并通过细胞病变测定nGAstV滴度.用0.06％甲醛溶液灭活纯化的nGAstV作为免疫原,免疫两周岁羊驼.首次免疫时用灭活纯化的nGAstV与等量弗氏完全佐剂乳化后免疫,第2-5次免疫用灭活纯化的nGAstV与等量弗氏不完全佐剂乳化.每间隔两周免疫一次,每次免疫剂量均为50μg.第5次免疫14 d后,通过间接ELISA方法测定羊驼血清中针对nGAstV的IgG抗体效价.待IgG抗体效价达到构建噬菌体抗体展示文库标准时,分离羊驼外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocyte,PBL),然后提取PBL总RNA将其反转录为cDNA,利用巢氏PCR方法扩增重链抗体重链可变区(variable domain of the heavy chain of heavy chain antibodies,VHH)基因,将其构建至 pComb噬菌体载体并结合噬菌体展示技术构建nGAstV Nb噬菌体展示文库,计算该文库库容量并分析其多样性.nGAstV作为靶抗原,通过三轮富集淘选初步获得与nGAstV反应的重组噬菌体Nb阳性克隆,将其克隆至pcDNA3.1-Fc真核表达载体并进行测序分析,将测序成功且序列不同的质粒转染至HEK-293F细胞中表达,并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定表达情况.以nGAstV为靶标抗原,利用间接ELISA方法和Western blot试验对表达成功的Nb进行特异性、反应活性验证,并以nGAstV ORF2蛋白为靶标抗原,利用间接ELISA方法对Nb进行亲和力验证,获得生物学活性较好的Nb.[结果]RT-PCR结果显示,nGAstV增殖成功;Reed-Muench法分析nGAstV滴度达4.38 Log10TCID50/mL.羊驼经5次免疫nGAstV后,通过间接ELISA方法测得其血清中针对nGAstV的抗体效价达到1:64 000;利用巢氏PCR方法扩增出VHH并成功构建库容量为3.8×108 CFU/mL的nGAstV Nb噬菌体展示文库;遗传进化树分析显示,该噬菌体Nb库多样性良好.三轮富集淘选后,初步获得39株与nGAstV反应的重组噬菌体纳米抗体阳性克隆,其中有25株序列不同;SDS-PAGE鉴定结果显示,共有10株Nb在HEK-293F细胞中表达成功.通过ELISA、Western blot验证进一步获得8株与nGAstV ORF2蛋白特异性反应的Nb,且1株Nb生物学活性最好.[结论]首次筛选到与nGAstV ORF2蛋白特异性反应的Nb,为nGAstV的基础研究和检测方法提供材料.

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