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基于novel-miR1检测家兔豆状囊尾蚴感染的滚环扩增方法的建立和应用

文献类型： 中文期刊

作者： 陈国梁;王立群;李艳萍;刘婷丽;李红;张少华;骆学农;强文军

作者机构：

关键词： 豆状囊尾蚴病;novel-miR1;滚环扩增

期刊名称： 中国寄生虫学与寄生虫病杂志

ISSN： 1000-7423

年卷期： 2023 年

页码：

收录情况： 北大核心（2020版） ; ; CSCD（2023-2024年度） ; ; 科技核心（2023版）

摘要： 目的 建立检测家兔豆状囊尾蚴感染的滚环扩增（RCA）方法。方法 以家兔血清中豆状囊尾蚴来源的novel-miR1为诊断靶标，设计连接序列和锁式探针，并对连接序列和锁式探针的比例、反应时间、酶用量、 dNTP用量以及扩增反应时间等5个重要条件进行优化，建立检测豆状囊尾蚴感染的RCA方法。将novel-miR1标准品倍比稀释为1 fmol/L至100 nmol/L的9个不同浓度的样品，评价RCA方法的灵敏度。用优化后的RCA方法分别检测健康家兔和豆状囊尾蚴感染家兔血清miRNA各20份（实验室保存样品），并通过受试者工作特征（ROC）曲线分析其敏感性和特异性。20只雌性家兔每只家兔经口感染1 000个豆状带绦虫虫卵，采集感染前和感染后每个月的家兔血样制备血清miRNA，用优化后的RCA方法进行检测，评价其应用效果。结果电泳结果显示，RCA扩增产物的DNA停留在加样孔中，形成一条明亮条带。反应条件优化试验结果显示，连接序列浓度为2μmol/L、锁式探针浓度为1μmol/L （连接序列和锁式探针的比为2∶1） T4 DNA连接酶为350 U、连接180 min时连接效率最高。在100μl的扩增体系中，dNTP浓度为0.5μmol/L，扩增240 min时，RCA扩增扩增效果最佳。优化后RCA的最低检测浓度为10 pmol/L。RCA检测健康家兔和豆状囊尾蚴感染家兔血清miRNA样品的平均荧光值分别为53.298±1.707和97.498±5.892，差异有统计学意义（t=7.206, P ＜0.01）。ROC分析结果显示，当阳性临界值为61.69时，RCA方法的敏感性和特异性均为95%, AUC为0.955 0，似然比为19.00。RCA检测豆状囊尾蚴感染后不同时间的家兔血清miRNA结果显示，20份阴性血清中19份检测结果为阴性，1份为阳性；感染后1个月的血清中，17份为阳性，2份为疑似，1份为阴性；感染后2个月的血清，1份为阴性，其余为阳性；感染后3个月的血清，3份为阴性，其余为阳性。结论 建立了检测家兔豆状囊尾蚴感染的RCA方法，该方法在豆状囊尾蚴感染后3个月内的家兔血清中检出novel-miR1，具有良好的应用潜力。

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[2]Identification and expression profiling of circulating mi-crornas in serum of cysticercus pisiformis-infected rabbits. Guoliang Chen,Liqun Wang,Tingli Liu,Yanping Li,Shaohua Zhang,Hong Li,Xuenong Luo. 2021

[3]Cysticercus pisiformis-derived novel-miR1 targets TLR2 to inhibit the immune response in rabbits. Guoliang Chen,Guiting Pu,Liqun Wang,Yanping Li,Tingli Liu,Hong Li,Shaohua Zhang,Xuelin Wang,Xiaolei Liu,Xuenong Luo. 2023

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