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猪MSTN、pAPN和CD163基因同步编辑的胚胎制备

文献类型： 中文期刊

作者： 谢浩;陈指龙;彭翠婷;潘颖婷;齐霖;赵玉兰;闭英连;宋子仪;唐中林

作者机构：

关键词： （1-1-2）CRISPR/Cas9;MSTN;pAPN;CD163;多基因编辑;PEF;胚胎

期刊名称：中国农业科技导报(中英文)

ISSN： 1008-0864

年卷期： 2025 年 27 卷

页码：

收录情况： 北大核心（2023版） ; ; CSCD（2025-2026年度） ; ; 科技核心（2024版） ; ; 农林核心（2024版）

摘要： CRISPR/Cas9作为一款强大的基因编辑工具，在猪的遗传改良中已经广泛应用。然而，单一基因的编辑无法满足多性状的同步改良。为利用CRISPR/Cas9基因编辑体系构建MSTN、pAPN和CD163多基因编辑猪胚胎成纤维细胞（porcine embryonic fibroblasts, PEF）并制备胚胎，首先，根据猪CD163、MSTN和pAPN蛋白功能结构域，选定MSTN外显子1、CD163外显子7及pAPN外显子2作为打靶区域，各设计2对sgRNAs，连接至骨架pX330载体，通过电转染至PEF，筛选每个基因编辑效率较高的sgRNA；然后，利用同源重组法将CD163、MSTN、pAPN单个基因的sgRNA表达盒组装成一体化串联表达系统，转化至Fast-T1感受态细胞并进行Sanger测序鉴定；最后，利用电转染方式将3基因敲除载体转染至PEF，用2.5μg·mL-1的嘌呤霉素进行药筛，挑选单克隆细胞，PCR扩增后进行Sanger测序，鉴定单克隆细胞MSTN、CD163、pAPN基因的打靶序列。结果显示，CD163、MSTN、pAPN基因的sgRNA1编辑效率高于sgRNA2，因此选择较高效率sgRNA1用于构建一体化质粒。质粒测序显示，3个基因的sgRNA表达盒成功连接到骨架pX330载体上。挑取45株转染3基因编辑质粒的单克隆细胞，测序结果显示，MSTN、pAPN、CD163基因的突变率分别为62%、26%、11%，其中有4株细胞实现了3个基因同时编辑（效率为8.9%）。进一步用编辑细胞进行体细胞核移植生产胚胎，与未编辑细胞生产的胚胎在体细胞融合率、胚胎卵裂率和囊胚率上均无显著差异；测序结果显示，胚胎水平的打靶结果与体细胞一致。综上，利用CRISPR/Cas9技术制备猪MSTN、pAPN、CD163基因同时编辑的PEF和胚胎，为多基因编辑克隆猪的制备奠定基础和提供参考。

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