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稳定表达Cas9蛋白的C2C12细胞株构建

文献类型： 中文期刊

作者： 刘玮玮;王伟;杨小淦;唐中林

作者机构：

关键词： （1-1-2）CRISPR/Cas9;C2C12细胞株;慢病毒包装体系;基因编辑

期刊名称：南方农业学报

ISSN： 2095-1191

年卷期： 2025 年 10 期

页码：

收录情况： 北大核心（2023版） ; ; CSCD（2025-2026年度） ; ; 科技核心（2024版） ; ; 农林核心（2024版）

摘要： [目的]优化慢病毒包装体系并建立能稳定表达Cas9蛋白的小鼠成肌细胞系(C2C12),为基因编辑技术研究提供细胞模型和理论参考.[方法]以C2C12细胞为研究对象,设对照组和试验组,调整三质粒(pmd2.g、pspax2和Cas9)用量配比以优化慢病毒包装体系.利用优化后的慢病毒包装体系将表达Cas9蛋白的质粒(lenti-Cas9-puro和lenti-Cas9-Blast)包装成慢病毒感染C2C12细胞.采用药物筛选富集和单克隆分选获得稳定表达Cas9蛋白的C2C12单克隆细胞株.利用基因组鉴定、免疫荧光染色、sgRNA检测等试验验证细胞株构建情况.[结果]慢病毒包装体系优化后,试验组质粒转染效率达90％以上,极显著高于对照组(80％)(P＜0.01);试验组慢病毒滴度提高至1.8×107TU/mL,极显著高于对照组(6.2×106 TU/mL)(P＜0.001).PCR结果显示,C2C12-Cas9稳转细胞株成功扩增出Cas9、puro和BSD序列,外源Cas9序列成功整合到C2C12细胞基因组中,而野生型的C2C12细胞不存在Cas9序列.免疫荧光染色结果表明,C2C12-Cas9稳转细胞株能表达Cas9蛋白.T7E1酶切和Sanger测序结果表明,整合的Cas9蛋白具有切割活性.[结论]通过调整三质粒用量配比成功优化慢病毒包装体系,提高质粒转染效率和慢病毒滴度.成功构建能稳定表达Cas9蛋白的C2C12细胞株,建立了构建稳转细胞株的相对成熟体系.

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