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利用sacB基因反向筛选法构建GFP分别融合于猪链球菌MapZ及PBP1b蛋白的融合菌株

文献类型： 中文期刊

作者： 卫东;陈平;高广娟;朱金鲁;武柳君;刘思国;张跃灵

作者机构：

关键词： 猪链球菌;无痕突变;sacB基因;反向筛选标记

期刊名称：中国预防兽医学报

ISSN： 1008-0589

年卷期： 2023 年 11 期

页码：

收录情况： 北大核心（2020版） ; ; CSCD（2023-2024年度） ; ; 科技核心（2023版） ; ; 农林核心（2020版）

摘要： 为在猪链球菌(S.suis)中引入高效的反向筛选标记,本研究根据S.suis密码子偏好性优化了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)蔗糖果聚糖酶基因sacB的密码子,并由公司合成后作为模板,采用PCR扩增sacB基因片段;采用PCR从相应模板中分别扩增S.suis中的启动子序列(Peno)及含壮观霉素抗性基因(spc)的片段;再经重叠延伸PCR扩增融合基因片段Peno-sacB-spc(PSS).以相应模板及引物分别经PCR扩增S.suis mapZ基因待融合位点上下游序列UP1和DN1及其pbp1b基因待融合位点上下游序列UP2和DN2、含正/反向筛选标记的片段PSS1和PSS2基因片段,以及用于替换PSS片段的绿色荧光蛋白(GFP)gfp1和gfp2基因片段;再分别通过重叠延伸PCR扩增构建中间菌株的融合片段UP1-PSS1-DN1、UP2-PSS2-DN2以及构建GFP融合菌株的融合片段UP1-GFP1-DN1、UP2-GFP2-DN2.采用同源重组的方法将UP1-PSS1-DN1和UP2-PSS2-DN2分别转化S.suis 05ZYH33菌株,经壮观霉素筛选引入PSS的中间菌株.PCR及测序鉴定结果表明获得了引入PSS片段的中间菌株PSS-mapZ和PSS-pbp1b.将WT、PSS-mapZ和PSS-pbp1b分别培养于含不同浓度蔗糖(10％、7.5％、5％和2.5％)的TSAS平板上,确定WT生长而PSS-mapZ和PSS-pbp1b中间菌株不生长的蔗糖浓度(用于筛选及构建GFP融合菌株).通过比较分析最终确定反向筛选GFP融合菌株的最适蔗糖浓度约为7％.通过同源重组的方法分别将UP1-GFP1-DN1片段转化PSS-mapZ菌株、UP2-GFP2-DN2片段转化PSS-pbp1b菌株,分别经含7％蔗糖(生长)及含壮观霉素(不生长)的TSAS平板筛选.随机选择经筛选获得的100个单菌落计算筛选的阳性率.各取6个单菌落经PCR及测序鉴定.结果显示,筛选菌株的阳性率在52％～75％.PCR及测序结果显示,获得的两种重组菌株中的gfp基因片段确实分别替换了PSS-mapZ和PSS-pbp1b中的相应PSS,表明正确构建了融合GFP的重组菌株GFP-mapZ和GFP-pbp1b.本研究首次构建了高效的正/反向筛选标记PSS,以及无痕的S.suis GFP-mapZ和GFP-pbp1b融合菌株,为快速无痕的S.suis遗传操作及深入研究S.suis相关分子机制奠定了基础.

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