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长角血蜱天冬氨酸蛋白水解酶8基因的鉴定及其抵抗田鼠巴贝虫感染作用的研究

文献类型： 中文期刊

作者： 朱昊天;周勇志;曹杰;王亚楠;张厚双;徐前明;周金林

作者机构：

关键词： 长角血蜱;人兽共患病;田鼠巴贝虫;天冬氨酸蛋白水解酶8;RNA干扰

期刊名称：中国寄生虫学与寄生虫病杂志

ISSN： 1000-7423

年卷期： 2024 年

页码：

收录情况： 北大核心（2023版） ; ; CSCD（2023-2024年度） ; ; 科技核心（2024版）

摘要： 目的 对长角血蜱天冬氨酸蛋白水解酶8 (hlcas8)基因进行鉴定，探究其在长角血蜱抵抗田鼠巴贝虫感染中的作用，为田鼠巴贝虫传播阻断疫苗的研究奠定基础。方法 提取长角血蜱RNA，逆转录为cDNA,PCR扩增hlcas8，测序后在GenBank中进行BLAST比对。用MEGA软件，采取邻接法构建基于cas基因的系统进化树。以叮咬田鼠巴贝虫感染小鼠的长角血蜱的若蜱为感染组，以叮咬正常小鼠的同批次若蜱为对照组。感染组与对照组各取9只蜱，提取RNA并逆转录为cDNA，采用定量PCR (qPCR)方法分析感染组与对照组蜱hlcas8基因相对转录水平差异；提取感染组和对照组长角血蜱的若蜱总蛋白，蛋白质免疫印迹（Western blotting）检测HLCAS8的相对表达量。合成hlcas8基因和荧光素酶基因的双链RNA (dsRNA)，显微注射至长角血蜱若蜱体内进行RNA干扰，12～24 h后，取活性良好的蜱吸食田鼠巴贝虫感染小鼠血，饱血后立即收集蜱，用探针法，实时PCR检测长角血蜱体内田鼠巴贝虫的18S rRNA基因，根据标准曲线计算对应含虫量。感染组和对照组hlcas8基因相对转录水平和蛋白相对表达水平的比较采用t检验。结果 PCR扩增获得的hlcas8基因长1 377 bp，序列提交GenBank获得的登录号为PP407944，其预测的氨基酸序列与长角血蜱CAS8 (GenBank:ABG48761.1)、镰形扇头蜱CAS8(GenBank:ALQ43547.1)的氨基酸序列一致性分别为21.26%和61.24%。系统进化树分析结果显示，hlcas8基因与长角血蜱cas基因均不在同一分支上，且亲缘关系较远；与镰形扇头蜱cas8基因（GenBank:ALQ43547.1）的亲缘关系较近，在同一分支上。qPCR分析结果显示，感染组长角血蜱hlcas8基因的相对转录水平为0.562±0.036，高于对照组的0.198±0.071 (t=7.91,P <0.01)。Western blotting结果显示，感染组长角血蜱HLCAS8蛋白的相对表达水平为0.460±0.013，高于对照组的0.346±0.007 (t=9.368,P <0.01)。RNA干扰沉默hlcas8后，长角血蜱若蜱体内hlcas8基因的相对表达水平为0.036±0.003，低于对照组的0.081±0.006 (t=10.68,P <0.01)。沉默hlcas8基因的蜱体内田鼠巴贝虫含虫量为3.35×10～6 copies/μl，高于对照组的1.35×10～6 copies/μl (t=4.570,P <0.05)。结论 HLCAS8是长角血蜱的凋亡相关分子，能够抵御田鼠巴贝虫感染长角血蜱，可以作为田鼠巴贝虫传播阻断疫苗的候选靶向分子。

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