文献类型： 中文期刊
作者： 赵为民;王慧利;曹少先;郭日红;王泽平;陈哲;徐奎;付言峰;李碧侠;任守文;程金花
作者机构：
关键词： CRISPR/Cas9;单碱基编辑;CD163基因;猪
期刊名称：畜牧兽医学报
ISSN： 0366-6964
年卷期： 2022 年 53 卷 04 期
页码：
收录情况： 北大核心（2020版） ; CSCD（2021-2022年度） ; 科技核心（2021版） ; 农林核心（2020版）
摘要： 旨在利用YE1-BE3-FNLS载体对猪的CD163基因进行C>T的单碱基突变，形成终止密码子TAA,从而导致CD163基因翻译的提前终止。利用网站在猪CD163基因的第7外显子筛选到高效率的sgRNA序列使其符合C5位点，并且C5后续的两个碱基为AA,CAA与起始密码子ATG之间的碱基数为3的整数倍。PCR扩增CD163-sgRNA和YE1-BE3-FNLS载体中的APOBEC-Cas9n-UGI片段，通过体外转录形成CD163-sgRNA和APOBEC-Cas9n-UGI mRNA。体外培养猪卵母细胞并进行孤雌激活，利用显微操作仪对孤雌胚胎进行CD163-sgRNA和APOBEC-Cas9n-UGI mRNA注射，待胚胎发育至桑椹胚和囊胚阶段，提取胚胎基因组DNA对单碱基编辑区域进行PCR扩增测序。结果显示，在49个候选sgRNA中成功筛选出一个CD163-sgRNA,利用PCR成功扩增了CD163-sgRNA和APOBEC-Cas9n-UGI片段，注射CD163-sgRNA和APOBEC-Cas9n-UGI mRNA后的猪孤雌胚胎发育到2～4细胞期。挑选注射的20个2～4细胞期胚胎经过PCR扩增与产物测序后发现有12个胚胎的CD163基因的第7外显子的预期位点C（num1479）>T,单碱基编辑效率约60%。对CD163-sgRNA的off-target分析发现，在错配3个碱基的情况下该CD163-sgRNA有5个off-target区域，对这5个区域进行PCR扩增和sanger测序分析后发现都没有发生C>T的突变。本研究利用YE1-BE3-FNLS工具在胚胎水平上对猪的CD163基因进行了单碱基编辑，成功使得该基因第7外显子预期位点（num1479）C变为T,从而使得密码子CAA变为TAA,可提前终止CD163基因的翻译。
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