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犬细小病毒CPV-2c SX-LC株感染性克隆的构建与病毒拯救

文献类型： 中文期刊

作者： 刘晨曦;赵冰兵;史智宾;王世达;王靖飞

作者机构：

关键词： 犬细小病毒;感染性克隆;反向遗传学;病毒拯救;病毒基因组

期刊名称：中国农业科学

ISSN： 0578-1752

年卷期： 2025 年 58 卷 17 期

页码：

收录情况： 北大核心（2023版） ; ; CSCD（2025-2026年度） ; ; 科技核心（2024版） ; ; 农林核心（2024版）

摘要： 【背景】犬细小病毒2型(canine parvovirus 2, CPV-2)属于细小病毒科细小病毒属，是一种无囊膜、单股负链DNA病毒，主要感染犬科动物，尤其对幼犬群体构成极大威胁。该病毒具有高度传染性和显著致死率，常引发犬类的急性肠炎或心肌炎，已成为影响全球范围内犬类养殖业的重要疫病之一。目前，CPV-2感染主要通过疫苗免疫预防，但仍有免疫犬发病报道。因此，针对当前流行的CPV-2毒株，开展其致病机制及免疫学特征的基础研究，已成为犬细小病毒防控策略优化的重要前提。【目的】建立针对当前流行的CPV-2c的反向遗传操作系统，为后续研究病毒的致病性、免疫逃逸机制及宿主适应性变异提供重要的实验工具。【方法】参考已发表的CPV-Y1毒株（GenBank编号：D26079.1）全基因组序列，设计特异性引物，采用分段PCR获得本实验室分离的CPV-2c SX-LC毒株的近全长的基因组序列，结合基因合成的CPV-2末端回文序列(ITRs)，将CPV-2完整基因组克隆至pBluescript SK(+)载体中，于基因组中引入Xho I酶切位点，作为酶切标签，构建了稳定、可操作的反向遗传质粒。随后，将纯化后的重组质粒转染至犬源F81细胞，进行病毒拯救并连续传代培养。通过观察细胞病变效应（CPE），间接免疫荧光试验（IFA）检测病毒主要抗原蛋白VP2，以及利用透射电子显微镜负染色观察病毒颗粒的形态来证明反向遗传系统成功构建。最后，通过一步生长曲线实验系统评估拯救病毒在F81细胞中的增殖动力学特征，并结合血凝试验（HA）测定其血凝活性，全面分析拯救病毒的基本生物学特性，并与亲本野生型毒株进行对比，验证所构建反向遗传系统的稳定性与实用性。【结果】酶切分析与序列测定结果确认，成功构建了完整的CPV-2c SX-LC全基因组质粒。将该重组质粒转染F81细胞并连续传代培养5代后，观察到细胞出现明显的CPE。针对出现CPE的细胞，进一步采用IFA检测，结果显示VP2抗原蛋白能够稳定表达。此外，病毒液经负染色处理后，透射电子显微镜观察显示具有典型CPV-2形态特征的病毒颗粒，进一步证明成功拯救获得了重组病毒rCPV-2c SX-LC。一步生长曲线及HA分析，结果表明拯救病毒与亲本毒株在增殖动力学和血凝活性方面基本一致，说明两者具有相似的生物学特性。【结论】通过优化ITRs的克隆，构建了具有CPV-2完整ITRs的质粒，较传统的构建方法在提升拯救效率和保证病毒基因组的完整性等方面有一定提升。构建的CPV-2c SX-LC反向遗传系统为进一步研究CPV的基础及应用提供了技术平台。

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