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四种主要黄萎病致病菌微滴数字PCR检测方法的建立及应用

文献类型： 中文期刊

作者： 翁慧婷;郭惠明;程红梅;李君;张超;刘海洋;苏晓峰

作者机构：

关键词： 作物黄萎病;轮枝菌;数字PCR;实时荧光定量;精准检测

期刊名称：生物技术通报

ISSN： 1002-5464

年卷期： 2025 年

页码：

收录情况： EI（2025版） ; ; 北大核心（2023版） ; ; CSCD（2025-2026年度） ; ; 科技核心（2024版） ; ; 农林核心（2024版）

摘要： 【目的】建立一种同时检测4种黄萎病致病菌的微滴式数字PCR （ddPCR）方法，为及时、准确定量监测该病原真菌的生长动态，进行早期诊断和风险评估奠定基础。【方法】通过比对4种黄萎病致病菌大丽轮枝菌（Verticillium dahliae, Vd）、长孢轮枝菌（V. longisporum, Vl）、非苜蓿轮枝菌（V. nonalfalfae, Vna）和黑白轮枝菌（V. albo-atrum, Vaa）的ITS （Internal transcribed spacer）序列（Vd,KY039312.1;Vl,KX058040.1;Vna,KT362917.1和Vaa,MH856937.1），选取保守区域设计引物和探针。结合微滴式数字PCR和实时荧光定量PCR （qPCR）筛选最佳引物，优化ddPCR最佳反应体系，并测定了方法的特异性与灵敏度。【结果】建立方法的最佳引物/探针组为Ver5；最佳退火温度为58℃，引物浓度为500 nmol/L和探针浓度为250 nmol/L。特异性检测结果显示，该方法能够特异性识别4种黄萎病致病菌，对包括7种真菌和6种细菌在内的非靶标微生物无交叉扩增；对于Vd、Vl、Vna、Vaa的检测限分别为2.1×10-6、1.6×10-6、6.9×10-4、3.6×10-5 ng/μL。选取50个棉花和50份土壤样品展开检测分析，结果表明相较于qPCR,ddPCR方法的检出率呈现出显著优势，且检测灵敏度分别提高了46%和51%。【结论】建立的ddPCR方法检测4种黄萎病致病菌特异性强，灵敏度高，稳定可靠，为黄萎病的精准检测提供了重要的技术手段。该方法有利于海关检验检疫与植物病虫害监管等领域，提高病害防控的科学性与时效性。

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