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表达Strep-tag II的重组塞内卡病毒的构建与鉴定

文献类型： 中文期刊

作者： 史家宝;蒙靓;肖培宇;范峻豪;安同庆;王海伟;于力

作者机构：

关键词： 塞内卡病毒;Strep-tag II;感染性克隆;抗原纯化

期刊名称：中国预防兽医学报

ISSN： 1008-0589

年卷期： 2023 年

页码：

收录情况： 北大核心（2020版） ; ; CSCD（2023-2024年度） ; ; 科技核心（2023版） ; ; 农林核心（2020版）

摘要： 为制备表达Strep-tagII的重组塞内卡病毒，本研究在SVA-I212V/S460L感染性克隆的基础上，采用重叠延伸PCR方法将Strep-tag II插入SVA VP1基因C段。将构建的感染性克隆转染至BHK-21细胞来拯救重组病毒，收集病变细胞上清，并将该病毒上清和野生型SVA分别感染BHK-21细胞，未感染病毒的BHK-21细胞作为阴性对照，感染后24 h采用间接免疫荧光方法对重组病毒鉴定，分别用鼠抗SVAVP2蛋白MAb5D10、鼠抗Streptag II MAb作为一抗。IFA结果显示以鼠抗SVAVP2蛋白MAb5D10为一抗，SVA-WT和rSVA-Strep重组病毒感染的细胞均出现绿色荧光，以抗Strep-tag II MAb作为一抗，仅有重组病毒rSVA-Strep感染的细胞出现绿色荧光，经SVA-WT感染的BHK-21细胞及阴性对照均没有绿色荧光，表明拯救了Strep-tagII标记的重组病毒并将其命名为rSVA-Strep。将r SVA-Strep重组病毒在BHK-21细胞中连续传10代，每隔2代采用引物VP1-F/VP1-R PCR扩增重组病毒基因并对第10代进行测序来鉴定rSVA-Strep重组病毒的遗传稳定性。结果显示每隔两代的重组病毒经PCR扩增后均出现约780 bp的目的条带，第10代重组病毒扩增的VP1基因测序结果显示Strep-tagII基因仍在重组病毒中，且无基因突变，表明r SVA-Strep重组病毒的遗传稳定性较强；将SVA-WT和rSVA-Strep重组病毒分别以0.01个MOI感染BHK-21细胞，在感染后4 h、8 h、12 h、24 h、36 h、48 h和72 h收获病毒并测定其病毒滴度，结果显示在病毒感染36 h内r SVA-Strep和SVA-WT生长动力学基本一致，表明Strep-tagII的引入在病毒感染36 h内对SVA的复制基本无影响。采用0.2%甲醛充分灭活rSVA-Strep病毒，并利用Strep-Tactin?XTPurification纯化试剂盒纯化该灭活病毒，将rSVA-Strep灭活病毒上清添加到Strep-Tactin亲和层析柱，分别用不同体积洗脱缓冲液依次洗脱病毒并通过western blot鉴定病毒纯化效果。对纯化过程中不同洗脱样本的western blot鉴定结果显示，E1、E2和E3均出现VP0和VP2两条带，且E1和E2的条带最明显，表明使用约2.2CV洗脱缓冲液为最佳洗脱体积；以上结果表明r SVA-Strep重组病毒可通过Strep-Tactin亲和一步法进行纯化。本研究成功在SVA病毒中插入Strep-tagII标签，可为SVA灭活疫苗的快速纯化提供技术手段，也可为其他病原的快速纯化方法的建立提供参考。

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