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腐败梭菌α毒素蛋白的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

文献类型： 中文期刊

作者： 马清龙;赵佳慧;王武斌;李学瑞;孙雨;李斌;储岳峰

作者机构：

关键词： 腐败梭菌;α毒素;原核表达;间接ELISA

期刊名称：中国兽医科学

ISSN： 1673-4696

年卷期： 2024 年

页码：

收录情况： 北大核心（2023版） ; ; CSCD（2023-2024年度） ; ; 科技核心（2024版） ; ; 农林核心（2020版）

摘要： 为建立绵羊腐败梭菌α毒素抗体间接ELISA检测方法，将腐败梭菌α毒素基因进行密码子优化后，通过基因合成连接到pGEX-4T-1载体，构建重组质粒pGEX-4T-1-α。将重组质粒转入到大肠杆菌BL21(DE3)PlysS感受态细菌，用IPTG诱导重组α毒素蛋白表达并纯化表达蛋白，切除表达蛋白携带的GST标签后，得到重组腐败梭菌α毒素蛋白。以腐败梭菌α毒素蛋白为包被抗原，建立腐败梭菌α毒素抗体间接ELISA检测方法。结果表明，腐败梭菌α毒素蛋白以200 ng/孔，绵羊血清稀释度为1︰200，封闭液为10 g/L BSA，家兔抗山羊HRP酶标二抗稀释度为1︰8000，避光显色20 min为最佳的ELISA条件。检测50份阴性血清，计算平均值（x?）、标准差(s)，依据（x?+2s）确定建立的腐败梭菌α毒素抗体间接ELISA检测方法的阴阳性临界值为0.244。检测血清敏感度为1︰6400；批内、批间重复性试验结果显示，该方法的变异系数均小于10%；特异性试验结果显示，该方法与绵羊B型产气荚膜梭菌、C型产气荚膜梭菌、绵羊布鲁菌、鼠伤寒沙门菌及羊痘病毒阳性血清均无交叉反应。用建立的间接ELISA和商品化腐败梭菌α试剂盒分别检测100份临床血清样本，结果表明这2种方法的阳性符合率为94.87%，阴性符合率为81.97%，总符合率为87.00%。对三联四防疫苗免疫绵羊血清的检测结果表明，本方法的检测结果能够更好地反映出接种疫苗后免疫绵羊血清中抗α毒素抗体的消长情况。该检测方法具有很好的敏感性、重复性和特异性，适用于腐败梭菌感染临床血清样品的检测和腐败梭菌疫苗免疫效果的评价。

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