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X染色体定点整合GFP元件的野猪诱导多能性干细胞系的建立

文献类型： 中文期刊

作者： 周心仪;杨利丹;高晨;魏新华;霍浩楠;邹惠影;余大为;杜卫华

作者机构：

关键词： 野猪;诱导多能干细胞;电转染;脂质体;X染色体定点整合

期刊名称：畜牧兽医学报

ISSN： 0366-6964

年卷期： 2025 年

页码：

收录情况： 北大核心（2023版） ; ; CSCD（2025-2026年度） ; ; 科技核心（2024版） ; ; 农林核心（2024版）

摘要： 本研究旨在建立具有稳定传代能力的野猪诱导多能干细胞系（induced pluripotent stem cells，iPSCs），并将外源基因定点整合于iPSCs的X染色体，为野猪的资源保存和开发利用提供技术支撑。利用PiggyBac转座子系统将8种多能性因子导入野猪成纤维细胞，诱导建立iPSCs系，并鉴定其多能性；分别采用电转染（3种程序）、化学转染试剂lipofectamine 3000（Lip 3000）和jetPRIME将表达绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的质粒转入野猪iPSCs，通过流式细胞仪分析转染效率筛选最优转染方案；结合CRISPR/Cas9和不依赖于同源重组的定点整合技术，将筛选获得的高效sgRNA与GFP表达元件共转染野猪iPSCs，PCR扩增目的片段，并测序鉴定GFP的定点整合。本研究将人源OCT4、SOX2、KLF4、C-MYC、NANOG、LIN28、NR5A2和miR302/367导入野猪成纤维细胞，诱导后20 d获得野猪iPSCs，其核型正常，碱性磷酸酶染色阳性，能稳定表达多能性因子OCT4、SOX2和NANOG，可体外形成拟胚体，并标记到三胚层的标志蛋白（β III-微管蛋白、α-平滑肌肌动蛋白和GATA6）。对于不同的电转染程序，CG104程序的细胞转染效率为(9.73±0.23)%，显著高于CA201（(7.34±0.03)%）和CB150程序组（(6.69±0.10)%）；而使用jetPRIME阳离子聚合物的细胞转染效率为(17.9±0.36)%，极显著高于Lip 3000（(14.07±0.85)%）。成功构建分别携带sgRNA与GFP表达元件的两个质粒，共转染野猪iPSCs后，PCR和测序结果显示，GFP表达元件定点插入至X染色体的预定位置，且能够稳定表达。本研究将野猪成纤维细胞诱导为可稳定传代的iPSCs，并通过不依赖同源重组技术的定点整合技术将GFP定点敲入iPSCs的X染色体，为野猪的基因编辑和家猪育种提供技术借鉴。

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