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基于TaqMan探针非洲猪瘟病毒E301R基因荧光定量PCR检测方法的建立及验证

文献类型： 中文期刊

作者： 葛海亮;张柯慧;于少雄;曹宏伟;李素;杨玉莹;仇华吉

作者机构：

关键词： 非洲猪瘟病毒;E301R基因;TaqMan探针;荧光定量PCR法;转录动力学

期刊名称：中国生物制品学杂志

ISSN： 1004-5503

年卷期： 2024 年 37 卷 09 期

页码：

收录情况： CSCD（2023-2024年度） ; ; 科技核心（2024版）

摘要： 目的 建立基于TaqMan探针的非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）E301R基因荧光定量PCR(fluorescent quantitative polymerase chain reaction,qPCR)检测方法，并进行验证，以期应用于临床样本中ASFV的检测。方法 通过对ASFV E301R基因序列进行分析，选择基因保守区设计特异性引物和TaqMan探针。PCR扩增E301R基因片段，克隆至pCAGGS载体，构建质粒标准品，建立基于TaqMan探针的qPCR检测方法，并验证方法的线性范围、精密性、特异性、敏感性及准确性。采用建立的方法检测92份临床样本，并与商品化ASFV荧光PCR试剂盒检测结果进行比较。另采用建立的方法对E301R基因转录动力学进行分析。结果 质粒标准品在1.6×（10～1～108）拷贝/μL范围内，与Ct呈良好的线性关系，线性回归方程为：y=-3.239 x+40.774,R2=0.994；重复性及中间精密性验证CV均<2%；除ASFV外，猪瘟病毒（classical swine fever virus,CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）、伪狂犬病病毒（pseudorabies virus,PRV）及猪圆环病毒2型（porcine circovirus type 2,PCV2）均未出现扩增曲线；最低可稳定检出1.6×10～1拷贝/μL的质粒标准品；浓度为1.6×10～2和1.6×10～1拷贝/μL质粒标准品的加标回收率在90%～110%之间。建立的方法与商品化ASFV荧光PCR试剂盒对92份临床样本检测结果的符合率为96.7%(Kappa=0.932,P=1.000)。E301R基因可能为ASFV感染的中期转录基因。结论 建立的基于TaqMan探针的qPCR检测方法具有良好的精密性、特异性、敏感性及准确性，可用于临床样本中ASFV的检测。

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