文献类型： 中文期刊
作者： 徐洁;申汶涛;朱启运;徐帅
作者机构：
关键词： A型流感病毒(IAV);聚合酶酸性蛋白;纳米抗体噬菌体展示文库;纳米抗体
期刊名称：中国畜牧兽医
ISSN： 1671-7236
年卷期： 2025 年 12 期
页码：
收录情况： 北大核心（2023版） ; ; CSCD（2025-2026年度） ; ; 科技核心（2024版） ; ; 农林核心（2024版）
摘要： 【目的】构建A型流感病毒(Influenza A virus,IAV)聚合酶酸性蛋白(polymerase acidic protein,PA)的特异性纳米抗体(nanobody,Nb)噬菌体展示文库,获得广谱特异性识别PA蛋白的纳米抗体,为IAV基础研究和应用研究提供生物材料。【方法】构建真核表达IAV PA的重组质粒,使用Flag标签抗原特异抗体亲和层析法获得纯化蛋白,并以此作为免疫原与弗氏佐剂混合,对羊驼进行免疫。第5次免疫14 d后,采用间接ELISA检测羊驼血清中针对PA蛋白的抗体效价。从羊驼外周血中分离出淋巴细胞(peripheral blood lymphocyte,PBL),提取总RNA后反转录成cDNA,利用巢式PCR技术扩增重链抗体的重链可变区(variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody,VHH)基因,构建pComb-VHH噬菌体重组质粒并电转化大肠杆菌SS320感受态细胞,构建纳米抗体噬菌体展示文库,同时测定该文库库容量及多样性。使用PA蛋白包被酶标板,淘选获得与PA蛋白反应的纳米抗体阳性克隆。对淘选获得的阳性克隆进行测序及真核表达,通过Western blotting、间接免疫荧光试验鉴定纳米抗体特异性。【结果】经测序验证,获得序列正确的pcDNA3.1-Flag-PA真核表达重组质粒,表达并纯化获得PA蛋白作为免疫原对羊驼进行免疫。经5次免疫后,羊驼血清中针对PA蛋白的抗体效价达到1∶64 000;成功扩增出VHH基因并构建重组率为100%、序列多样性为90%、库容量为6.5×10～7 CFU/mL的纳米抗体噬菌体展示文库。经过3轮富集淘选,获得6株功能区序列不同的PA蛋白纳米抗体,分别为Nb13、Nb14、Nb16、Nb20、Nb42和Nb72,其中纳米抗体Nb16可广谱特异性识别不同亚型IAV的PA蛋白。【结论】本研究成功构建IAV PA蛋白纳米抗体噬菌体展示文库,筛选获得1株广谱特异性识别IAV PA蛋白的纳米抗体。
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