数字农科院2.0

致马属动物流产沙门氏菌通用型间接ELISA抗体检测方法的建立与应用

文献类型： 中文期刊

作者： 郭奎;张泽楠;李帅杰;初晓雨;王垚鑫;郭巍;胡哲;王晓钧

作者机构：

关键词： 马流产沙门氏菌病;ompA;通用型;iELISA;诊断

期刊名称：中国农业科学

ISSN： 0578-1752

年卷期： 2023 年 56 卷 12 期

页码：

收录情况： 北大核心（2020版） ; ; CSCD（2023-2024年度） ; ; 科技核心（2023版） ; ; 农林核心（2020版）

摘要： 【目的】通过筛选引起马流产的4种沙门氏菌(Salmonella)共同的优势抗原,建立一种敏感高、特异强的通用型间接ELISA(iELISA)抗体检测方法,实现对马群中沙门氏菌抗体的快速高通量检测。【方法】首先利用马流产沙门氏菌阳性血清、阴性血清分别与马流产沙门氏菌全菌抗原进行免疫共沉淀(pull down)试验,筛选出马流产沙门氏菌优势抗原；根据质谱分析结果找到优势抗原基因,将优势抗原基因与其他3种致马流产沙门氏菌病的鼠伤寒沙门氏菌、都柏林沙门氏菌、肠炎沙门氏菌进行序列比对验证其保守性；其次根据抗原性分析对优势抗原编码基因进行分段表达,设计3对引物,利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增沙门氏菌优势抗原基因并将其分别克隆至原核表达载体pET28a；测序分析后将构建正确的重组质粒分别转化入大肠杆菌(Escherichia coli E.coli)Rosetta(DE3)中并加入0.6 mmol·L^(-1)异丙基-β-D-硫代半乳糖甘(Isopropy-β-D-thiogalactoside,IPTG)进行诱导表达,观察蛋白的表达形式；蛋白纯化后通过Western blot验证蛋白的反应原性和广谱性；然后利用纯化后蛋白作为包被抗原,通过对包被抗原量、血清和第二抗体浓度等条件进行优化建立马流产沙门氏菌病间接ELISA抗体诊断方法,并对该方法的特异性、敏感性进行评估。最后将该方法应用于试验感染马血清及临床样本的检测,并将检测结果同凝集试验结果比较。【结果】筛选出的马流产沙门氏菌优势抗原是ompA(Outer Membrane Protein,OMP),通过序列比对,该蛋白氨基酸序列与同属鼠伤寒沙门氏菌、都柏林沙门氏菌、肠炎沙门氏菌同源性99.4%—100%,具有很好的保守性；PCR扩增后成功获得3条与预期符合的目的基因；成功构建了pET28a-ompA1、pET28a-ompA2、pET28a-ompA33个重组质粒。SDS-PAGE结果表明,在24℃、0.6 mmol·L^(-1) IPTG诱导5 h下,含有pET28a-ompA1、pET28a-ompA2、pET28a-ompA3的重组菌均表达了相应蛋白,其中重组ompA1和ompA2蛋白以包涵体形式表达,重组ompA3蛋白以可溶性形式表达；Western blot显示,重组蛋白ompA3可与马流产沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、都柏林沙门氏菌、肠炎沙门氏菌阳性血清发生特异性反应,证明重组ompA3蛋白具有良好的反应原性,可以作为沙门氏菌属抗血清检测用抗原；以ompA3蛋白作为包被抗原建立了间接ELISA方法,在最大P/N比确定的最佳反应条件如下:最佳包被抗原浓度为1μg·mL^(-1),待检血清(1﹕200)37℃作用1 h,酶标抗马二抗(1﹕10000稀释),TMB在37℃孵育10 min,待检血清OD450>0.143判定为阳性,特异性试验结果显示,该包被抗原与常见马传染病阳性血清无交叉反应。通过对沙门氏菌静脉注射感染马的血清样品进行抗体检测,iELISA可以持续监测抗体阳性到116 d,相比微量凝集(69 d)多监测了47 d,因此iELISA具有更好的敏感性。利用建立的iELISA方法对8个不同牧场180份血清进行抗体检测,其抗体平均阳性检出率为63.3%,比微量凝集阳性检出率高53.9%。【结论】成功筛选到了马流产沙门氏菌病4种病原的共同优势抗原ompA,实现了对该蛋白的可溶性表达,建立了马流产沙门氏菌病通用型iELISA抗体诊断方法,该方法可以实现对临床样本马流产沙门氏菌抗体的检测,该方法具有特异性强、敏感性高,可以作为马流产沙门菌病抗体检测的一种有效工具。

分类号：

  • 相关文献

[1]鸭疫里氏杆菌PCR方法初步建立及应用. 孙龚,郭东春,刘家森,姜骞,司昌德. 2011

[2]犬瘟热病毒N基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达及应用. 冯佩平,张蕾,柴秀丽,张海玲,赵建军,胡博,白雪,高晗,邵西群,闫喜军,赵权,徐磊. 2012

[3]我国通用型联合收割机现状与发展思考. 王刚,吴崇友,伍德林. 2013

[4]口蹄疫病毒通用型金标检测试纸条诊断方法的建立. 任维维,梁仲,智晓莹,祁光宇,刘湘涛,才学鹏,蒋韬. 2012

[5]口蹄疫病毒通用型结构蛋白抗体间接ELISA检测方法的建立. 张慧艳,李坤,孙梦阳,邢向川,付元芳,李平花,李冬,卢曾军,曹轶梅. 2025

[6]Influence of Different Processing Treatments on the Detectability of Nucleic Acid and Protein Targets in Transgenic Soybean Meal. Tian, Fang,Guan, Qingfeng,Wang, Xiumin,Teng, Da,Wang, Jianhua,Tian, Fang,Guan, Qingfeng,Wang, Xiumin,Teng, Da,Wang, Jianhua,Tian, Fang.

[7]Characterization of parainfluenza virus 5 from diarrheic piglet highlights its zoonotic potential. Ibrahim, Yassein M.,Zhang, Wenli,Werid, Gebremeskel Mamu,Zhang, He,Pan, Yu,Zhang, Lin,Xu, Yunfei,Li, Changwen,Chen, Hongyan,Wang, Yue. 2022

[8]OmpA is a virulence factor of Riemerella anatipestifer. Hu, Qinghai,Han, Xiangan,Zhou, Xiaojin,Ding, Chan,Zhu, Yinyu,Yu, Shengqing.

[9]Peptide Aptamer PA3 Attenuates the Viability of Aeromonas veronii by Hindering of Small Protein B-Outer Membrane Protein A Signal Pathway. Liu, Peng,Chang, Huimin,Xu, Qi,Wang, Dan,Tang, Yanqiong,Hu, Xinwen,林敏,Liu, Zhu. 2022

[10]Isolation and characterization of a protective monoclonal antibody targeting outer membrane protein (OmpA) against tuberculosis. Li, Huoming,Ji, Jiahong,Qu, Mengjin,Ma, Xiuling,Zuo, You,Tang, Minghui,Zeng, Lingyuan,Li, Hao. 2025

[11]副溶血弧菌SH112株OmpA蛋白的高效表达及免疫学特性. 王亚磊,王权,白雪瑞,别闯南,陈兆国,韩先干,蒋蔚. 2019

[12]牛分枝杆菌细胞壁相关蛋白表达及免疫原性分析. 亓英芳,杜艳芬,刘慧芳,赫明雷,司微,倪洪波,王春来,刘思国. 2009

[13]奶牛衣原体ompA基因的克隆及序列分析. 宋竹青,魏彦明,周继章,曹小安,王光华,邱昌庆. 2009

[14]副溶血弧菌ompA基因缺失株的生物学特性及致病性分析. 白雪瑞,王权,陈永军,万莹,凌娇,王亚磊,蒋蔚. 2018

[15]牛病毒性腹泻病毒RT-PCR方法的建立. 张康,王丹阳,王旭荣,张凯,张景艳,王磊,李建喜. 2018

[16]非洲猪瘟——我国养猪业的重大威胁. 罗玉子,孙元,王涛,仇华吉. 2018

[17]无人机低空数字图像诊断棉花苗情技术. 雷亚平,韩迎春,王国平,冯璐,杨北方,范正义,魏晓文,王占彪,支晓宇,熊世武,李亚兵. 2017

[18]非洲猪瘟-我国养猪业的重大威胁. 罗玉子,孙元,王涛,仇华吉. 2018

[19]38例新生儿化脓性脑膜炎脑脊液检测结果的病程相关性特征. 华雪莹,蔡方成,赵智,余加林. 2018

[20]儿童坏死性肺炎诊治进展. 费文祎,罗健. 2018

作者其他论文 更多>>