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暗黑鳃金龟Hpv ATPase B克隆、表达及与Bt Cry8Ea3毒素结合特性

文献类型： 中文期刊

作者： 乔英翠;王薄毓;王倩;赵丹;郭巍;宁文烁;常梦颖;王海;陆秀君

作者机构：

关键词： 暗黑鳃金龟;V-ATPase B;苏云金芽孢杆菌;Cry8Ea3毒素;ELISA;免疫荧光分析;细胞毒性

期刊名称：中国农业科学

ISSN： 0578-1752

年卷期： 2025 年 58 卷 10 期

页码：

收录情况： 北大核心（2023版） ; ; CSCD（2025-2026年度） ; ; 科技核心（2024版） ; ; 农林核心（2024版）

摘要： 【目的】探明暗黑鳃金龟（Holotrichia parallela）幼虫HpvATPase B的功能，明确该蛋白在苏云金芽孢杆菌（Bacillusthuringiensis,Bt）晶体蛋白杀虫中的作用。【方法】基于暗黑鳃金龟转录组数据，克隆HpvATPase B开放阅读框；利用原核表达系统体外表达HpvATPase B，并进行Western blot检测；利用qRT-PCR测定HpvATPase B在暗黑鳃金龟3龄2 d幼虫不同组织中的表达水平；采用配体印迹试验及ELISA技术对HpvATPase B蛋白与Bt Cry8Ea3体外结合特性进行分析；利用Sf9细胞转染构建转HpvATPase B昆虫细胞系，通过免疫荧光法、细胞生物测定研究HpvATPase B与Bt Cry8Ea3的结合及Bt Cry8Ea3处理后细胞死亡率的变化。【结果】克隆得到HpvATPase B（GenBank登录号：MZ004965），该基因全长1 497bp，编码498个氨基酸，预测蛋白质分子量为55 kDa，等电点为5.51；预测有3个N-糖基化位点(239N、333N、458N)和4个O-糖基化位点(4S、8T、23S、28S)。HpvATPase B氨基酸序列与双叉犀金龟（Trypoxylus dichotomus）(GenBank登录号：GJQ75664.1)和棕榈象甲（Oryctes borbonicus）(GenBank登录号：KRT83436.1)V-ATPase B蛋白的支持率最高，达55%；构建得到pET30a-HpvATPase B重组表达质粒，体外原核表达得到大小为55 kDa的HpvATPase B蛋白，诱导后8 h表达量最高；HpvATPaseB在马氏管中表达量最高；配体结合试验结果表明，HpvATPase B蛋白可以与Bt Cry8Ea3蛋白特异结合而与Bt Cry1Ab35不结合；ELISA测定HpvATPase B蛋白与Bt Cry8Ea3、Cry1Ab35的亲和力，与Bt Cry8Ea3结合力强，Kd为7.20 nmol·L-1，而与Cry1Ab35不结合，亲和力不随Cry1Ab35浓度变化而变化；构建了pFastBacTM HTA-HpvATPase B并成功得到Sf9转基因细胞，免疫荧光测定表明转基因细胞表达的HpvATPase B蛋白与Cry8Ea3毒素蛋白发生了特异结合；细胞生物测定表明，当Cry8Ea3蛋白浓度为10、100μg·mL-1时，转基因细胞的平均校正死亡率分别为25.92%、75.53%，且均与对照差异显著（P<0.05），说明HpvATPase B为Bt Cry8Ea3受体蛋白。【结论】体外结合试验、免疫荧光及细胞毒性试验鉴定得到暗黑鳃金龟幼虫HpvATPase B蛋白是Bt Cry8Ea3的受体蛋白，参与Bt Cry8Ea3对暗黑鳃金龟幼虫的毒杀过程。

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