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CRISPR/Cas9介导的USP30基因敲除细胞系的建立及其对塞内卡病毒增殖的影响

文献类型： 中文期刊

作者： 赵振翔;张向乐;杨帆;曹伟军;顾峰幸;李康丽;郑海学;王雯慧;朱紫祥

作者机构：

关键词： CRISPR/Cas9;USP30;基因敲除细胞;塞内卡病毒

期刊名称：微生物学报

ISSN： 0001-6209

年卷期： 2023 年

页码：

收录情况： 北大核心（2020版） ; ; CSCD（2023-2024年度） ; ; 科技核心（2023版）

摘要： 【目的】利用CRISPR/Cas9技术建立USP30基因敲除的人胚胎肾细胞（Human Embryonic Kidney 293T Cells， HEK-293T）细胞系，为开展宿主泛素特异性蛋白酶30（USP30）蛋白的功能研究建立了细胞模型；同时，初步探究USP30蛋白在病毒感染过程中的作用。【方法】根据Ensemble数据库查询USP30基因序列， 定位USP30在基因组中不同转录本重叠区的第一个外显子段，设计并合成2对引导RNA（sgRNA），分别构建在pX459载体中；将pX459-USP30-sgRNA质粒转染HEK-293T细胞，并用嘌呤霉素处理，筛选出转染阳性的细胞，然后通过有限稀释法筛选单克隆细胞，通过Western blotting及测序检测USP30基因的敲除。通过Western blotting及实时荧光定量PCR分析比较塞内卡病毒（SVA）在野生型和USP30基因敲除HEK-293T细胞中的复制差异。【结果】Western blotting及测序证实USP30基因敲除单克隆细胞系构建成功。进一步实验发现，SVA在USP30基因敲除细胞中的复制水平显著低于野生型细胞。【结论】成功构建USP30基因敲除的HEK-293T细胞系，首次证明USP30对SVA的复制具有促进作用，为进一步揭示USP30相关免疫反应和SVA感染过程的作用机制提供了良好的细胞模型，也为开展宿主USP30蛋白调控病毒复制的机制研究提供了关键工具和一定的理论依据。

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