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ATG16基因缺陷Vero细胞系的建立及其抗小反刍兽疫病毒功能分析

文献类型： 中文期刊

作者： 赵庆露;陈红梅;韦定呈;朱学亮;王炫杰;胡占颖;李瑞哲;张瑞

作者机构：

关键词： ATG16基因;小反刍兽疫病毒(PPRV);Vero细胞;病毒复制;自噬

期刊名称：中国畜牧兽医

ISSN： 1671-7236

年卷期： 2026 年

页码：

收录情况： 北大核心（2023版） ; ; CSCD（2025-2026年度） ; ; 科技核心（2024版） ; ; 农林核心（2024版）

摘要： 【目的】利用CRISPR/Cas9技术构建自噬相关基因ATG16敲除的Vero细胞，并探究ATG16基因敲除对小反刍兽疫病毒（PPRV）复制的影响，为深入理解ATG16在抗病毒天然免疫中的作用机制及开发新的PPRV防控策略提供基因资源和理论依据。【方法】使用在线工具（红棉系统）设计ATG16基因gRNAs。将gRNA克隆到CRISPR-UTM表达载体，构建ATG16基因敲除载体。采用电转法将ATG16基因敲除载体转入Vero细胞。使用5 μg/mL嘌呤霉素筛选阳性克隆。通过靶位点扩增及测序验证筛选出成功敲除ATG16基因的阳性克隆。通过Western blotting检测基因敲除细胞中ATG16的表达情况。利用半数组织培养感染剂量(TCID50)、实时荧光定量PCR及Western blotting检测ATG16基因敲除后PPRV复制的变化情况。利用Western blotting检测敲除ATG16基因对细胞自噬的影响。【结果】PCR结果显示，筛选的阳性克隆靶位点无扩增片段。测序结果显示，靶标区域被删除61 bp，表明成功构建ATG16基因敲除的Vero细胞株。Western blotting结果表明，与野生型Vero细胞相比，敲除细胞中没有ATG16蛋白表达。Western blotting、TCID50和实时荧光定量PCR结果显示，与野生型Vero细胞相比，ATG16基因敲除细胞中PPRV N基因相对表达水平显著下调（P＜0.05），PPRV N蛋白表达被显著抑制，PPRV滴度显著降低（P＜0.05）。Western blotting结果显示，PPRV感染ATG16敲除细胞不能诱导微管相关蛋白1轻链3（LC3）-Ⅱ（LC3-Ⅱ）的形成。【结论】本研究利用CRISPR/Cas9技术构建了ATG16基因敲除的Vero细胞，并发现敲除ATG16基因可抑制PPRV在Vero细胞中复制和诱导细胞自噬的能力，为深入探索ATG16调控PPRV复制的分子机制奠定了基础。

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