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猫杯状病毒HRB-SS株cDNA感染性克隆的构建与病毒的拯救

文献类型： 中文期刊

作者： 孙伟尧;宋海军;刘春国;杨德成;王靖飞

作者机构：

关键词： 猫杯状病毒;cDNA感染性克隆;反向遗传操作系统

期刊名称：中国预防兽医学报

ISSN： 1008-0589

年卷期： 2023 年

页码：

收录情况： 北大核心（2020版） ; ; CSCD（2023-2024年度） ; ; 科技核心（2023版） ; ; 农林核心（2020版）

摘要： 为构建猫杯状病毒(FCV) HRB-SS株的感染性克隆，本研究合成3’端含有丁肝病毒核酶(Hepatitis delta ribozyme,HdvRz)序列的HRB-SS株全长基因组序列，将该序列插入pOK12-CMV载体，获得含有FCV HRB-SS全长基因组cDNA克隆的重组质粒pFCV-HRB-SS。将重组质粒pFCV-HRB-SS转染猫肾细胞(CRFK)细胞，48 h即可观察到典型细胞病变，将病变细胞的上清接入未感染的CRFK细胞进行传代培养，连续传5代，从感染的细胞上清中获得拯救病毒。采用FCV VP1蛋白MAb，经间接免疫荧光试验检测，结果显示拯救病毒与亲本毒均可观察到特异性荧光，而未感染病毒的对照组细胞无荧光信号；各组细胞负染色后经电镜观察可见病毒粒子呈典型的杯状结构。提取拯救病毒和亲本病毒基因组RNA经RT-PCR扩增、 I酶切鉴定及测序分析。结果显示，拯救病毒含有C5724G位点突变的分子标记，消除了I酶切位点，不同于亲本毒株。表明获得拯救病毒rFCV HRB-SS。采用蚀斑形成试验和一步生长曲线试验进一步检测rFCV HRB-SS，结果显示，rFCV HRB-SS与亲本株具有一致的复制能力和体外生长能力。本研究利用真核启动子构建的FCV HRB-SS株全长cDNA感染性克隆系统可直接进行细胞内转录，减少了操作流程，有效防止了操作污染，具有操作简便，拯救效率高的优势，为后续FCV基因功能研究和新型疫苗研发奠定了基础。

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