文献类型： 中文期刊
作者： 董泽霞;林鑫;周期律;王楠;黄雷;刘志国;冯政;牟玉莲
作者机构：
关键词： CRISPR/Cas9;CD163基因;永生化猪肺泡巨噬细胞系(iPAMs);猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)
期刊名称：中国畜牧兽医
ISSN： 1671-7236
年卷期： 2024 年 08 期
页码：
收录情况： 北大核心（2023版） ; ; CSCD（2023-2024年度） ; ; 科技核心（2024版） ; ; 农林核心（2020版）
摘要： 【目的】获得分化抗原163（cluster of differentiation 163,CD163）基因敲除的永生化猪肺泡巨噬细胞系（immortalized porcine alveolar macrophages,iPAMs）,并从细胞水平研究CD163蛋白在猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）入侵过程中的作用。【方法】将靶向CD163基因第7外显子的sgRNA质粒（pX330-sgCD163）转染至iPAMs,转染48 h后通过有限稀释法筛选单克隆细胞并进行基因型鉴定,通过Western blotting和脱靶分析来筛选CD163基因敲除的iPAMs;通过实时荧光定量PCR、Western blotting、间接免疫荧光试验（indirect immunofluorescence assay,IFA）和半数细胞培养物感染量(50%tissue culture infective dose,TCID50)等试验分析CD163基因敲除的iPAMs感染PRRSV的特征。【结果】测序结果表明,100株单克隆细胞中有1株CD163双等位基因敲除的iPAMs,敲除效率为1%;Western blotting结果显示,CD163基因敲除的iPAMs中检测不到CD163蛋白的表达,且在预测的脱靶位点未检测到脱靶效应。实时荧光定量PCR结果表明,与野生型iPAMs组相比,CD163基因敲除的iPAMs组病毒拷贝数极显著降低（P<0.01）;Western blotting和IFA结果表明,在接毒24 h后的CD163基因敲除的iPAMs组中未检测到PRRSV-N蛋白的表达;TCID50试验结果同样显示,在CD163基因敲除的iPAMs组中未观察到细胞病变。【结论】本研究利用CRISPR/Cas9编辑系统成功构建了CD163基因敲除的iPAMs,该细胞系可以完全抵抗PRRSV感染。该细胞系的建立为后续研究PRRSV与CD163蛋白的互作机制提供了新型试验材料。
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