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CRISPR/Cas9介导的CD71基因编辑IPI-2I细胞系的建立

文献类型： 中文期刊

作者： 聂雨欣;袁茂莎;王婉洁;王楠;孙亚茹;刘志国;牟玉莲

作者机构：

关键词： 猪;CRISPR/Cas9;CD71基因;IPI-2I细胞

期刊名称：中国畜牧兽医

ISSN： 1671-7236

年卷期： 2025 年 52 卷 10 期

页码：

收录情况： 北大核心（2023版） ; ; CSCD（2025-2026年度） ; ; 科技核心（2024版） ; ; 农林核心（2024版）

摘要： 【目的】通过CRISPR/Cas9技术获得分化抗原71(cluster of differentiation 71,CD71)基因编辑的猪回肠上皮(immortalized porcine intestinal-2I,IPI-2I)细胞系,为进一步在细胞水平上研究CD71基因功能及其在猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)感染中的作用提供材料。【方法】针对CD71基因第3外显子及其相邻内含子区域设计5条sgRNAs,并将其连接至pX458-GFP载体；在猪胎儿成纤维(porcine embryonic fibroblast,PEF)细胞中通过T7E1酶切试验对不同sgRNA载体进行活性检测；选择切割效率较高的2个sgRNAs载体质粒分别电转染至IPI-2I细胞中,48 h后通过流式细胞仪收集带有绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的单个细胞至96孔细胞培养板中扩大培养,筛选单克隆细胞；通过PCR扩增和TA克隆技术对单克隆细胞进行基因型鉴定,获得CD71基因编辑的IPI-2I细胞系。【结果】质粒测序结果表明,5条sgRNAs均成功连接至pX458-GFP载体；T7E1酶切结果显示,转染的5个sgRNAs质粒组均产生了切割,其中,pX458-sgRNA1和pX458-sgRNA4切割效率较高,分别为35.8%和44.1%。流式细胞术分选结果显示,转染pX458-sgRNA1和pX458-sgRNA4的阳性细胞比例分别为29.8%和25.7%；PCR扩增结果显示,获得的65株单克隆细胞中有14株细胞发生了基因编辑,编辑效率为22%；TA克隆结果显示,14株基因编辑细胞中有5株为单等位基因编辑,9株为双等位基因编辑。【结论】本研究利用CRISPR/Cas9技术成功构建了CD71基因编辑的IPI-2I细胞系,获得了CD71基因单等位基因编辑和双等位基因编辑细胞。试验结果为明确CD71基因功能及其介导TGEV感染的作用机制提供了良好的细胞模型。

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