文献类型： 中文期刊
作者： 王欢;朱化彬;李俊良;邹惠影;赵善江
作者机构：
关键词： 荷斯坦奶牛;无角;Pc位点;Tild-CRISPR/Cas9;同源重组载体
期刊名称：中国畜牧兽医
ISSN： 1671-7236
年卷期： 2021 年 9.0 期
页码：
收录情况： 北大核心（2020版） ; 农林核心（2020版） ; 科技核心（2020版）
摘要： 试验旨在利用Tild-CRISPR/Cas9系统介导的同源重组技术制备纯合无角种公牛细胞系。针对控制无角性状的Pc靶位点设计sgRNA,T7E1酶切和测序检测突变效率;以pUC57为骨架连接Pc片段及其两侧约800 bp的同源序列左臂（L）和右臂（R）,双酶切获得同源重组片段后与sgRNA共同转染至荷斯坦种公牛耳缘成纤维细胞中,筛选获得单细胞克隆并鉴定。结果显示,试验成功构建了6个sgRNA（1-6）,并筛选获得了突变效率最高的sgRNA1,其突变效率为32.6%;成功获得了长度为1 901 bp基因序列完全正确的同源重组片段;共获得147个单细胞克隆,其中8个单细胞克隆发生正确的单等位Pc位点插入,1个单细胞克隆发生正确的双等位Pc位点插入。外源基因残留检测结果显示,单细胞克隆没有Cas9基因残留,可作为后续克隆生产优秀无角纯合胚胎的核供体细胞。本研究成功利用Tild-CRISPR/Cas9定点编辑的方法获得了Pc位点纯合插入的无外源Cas9基因残留的无角牛耳缘成纤维细胞系,为将来优秀无角体细胞克隆种公牛的培育以及主要功能基因研究提供了良好的材料储备和技术平台。
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