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猪塞内卡病毒A RT-RAA-CRISPR/Cas12a可视化检测方法的建立

文献类型： 中文期刊

作者： 蒋成辉;郭容霞;李小明;常艳燕;王会宝;刘萍;王晶;杨进才;曾巧英

作者机构：

关键词： 逆转录-重组酶聚合酶等温扩增(RT-RAA);CRISPR/Cas12a;猪塞内卡病毒A;可视化检测

期刊名称：农业生物技术学报

ISSN： 1674-7968

年卷期： 2025 年 33 卷 11 期

页码：

收录情况： 北大核心（2023版） ; ; CSCD（2025-2026年度） ; ; 科技核心（2024版） ; ; 农林核心（2024版）

摘要： 猪(Sus scrofa)塞内卡病毒A(Senecavirus A, SVA)是小RNA病毒科塞内卡病毒属的唯一成员，能够引起猪的水疱病和新生仔猪死亡，威胁着全球养猪业的发展。为了建立一种基于逆转录-重组酶聚合酶等温扩增(reverse transcription-recombinase polymerase amplification, RT-RAA)和CRISPR/Cas12a技术检测SVA的可视化方法。本研究根据SVA基因组保守序列，设计3对RT-RAA引物、向导RNA靶向序列(CRISPR RNA, crRNAs)以及单链DNA探针(single-stranded DNA, ssDNA)。通过正交试验优化crRNA与来源于毛螺科细菌Cas12a核酸酶(LbCas12a)的最佳反应浓度。同时，评价RT-RAA-CRISPR/Cas12a方法的敏感性、特异性和重复性，并对已知背景的110份临床样本进行模拟检测。结果显示，crRNA与LbCas12a的最佳反应浓度为100和200 nmol/L。以RNA标准品(SD-RNA)为模板，RT-RAA-CRISPR/Cas12a方法灵敏性可达到15.1 copies/μL。所建立的RT-RAA-CRISPR/Cas12a方法特异性高，不与猪瘟病毒(Clssical swine fever virus, CSFV)、猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2, PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)以及口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus, FMDV)发生交叉反应。重复性试验显示，批内变异系数(CV)小于5%，批间CV小于10%，表明该方法具有良好的重复性。临床样本检测与q PCR检测结果相当，符合率为100%。综上所述，本研究成功建立了一种特异性强、灵敏性高、重复性好的可视化RT-RAA-CRISPR/Cas12a检测方法，可用于SVA的早期有效监测和流行病学调查。

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