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非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位鉴定

文献类型： 中文期刊

作者： 冯春莹;张朝霞;刘云飞;黄丽;翁长江

作者机构：

关键词： 非洲猪瘟病毒;p54蛋白;单克隆抗体;抗原表位

期刊名称：中国农业科学

ISSN： 0578-1752

年卷期： 2024 年 19 期

页码：

收录情况： 北大核心（2023版） ; ; CSCD（2023-2024年度） ; ; 科技核心（2024版） ; ; 农林核心（2020版）

摘要： [目的]获得可溶性非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)p54蛋白和抗p54蛋白的单克隆抗体(monoclonal antibodies,mAb),并分析其识别的线性抗原表位,为p54蛋白结构和功能的研究及血清学诊断试剂的研发奠定基础.[方法]构建了重组原核表达质粒pET-21a-E183L,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,表达并利用Ni2+柱和分子筛纯化得到p54重组蛋白.以该蛋白为抗原免疫5周龄SPF级BALB/c小鼠,每两周免疫一次,共免疫3次,首免时将p54蛋白与弗氏完全佐剂混匀乳化(150μg/只),二免、三免使用弗氏不完全佐剂.三免7 d后对小鼠进行尾部采血,使用ELISA方法测定小鼠血清抗体效价,选取效价高的小鼠进行加强免疫.3d后取小鼠脾细胞与SP2/0细胞进行融合,利用重组p54蛋白作为包被抗原,间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞,有限稀释法进行克隆纯化,直至筛出能够稳定分泌抗体的mAb细胞株,并制备腹水.以pCAGGS-Flag-E183L质粒转染的HEK293T细胞和ASFV Pig/HLJ/18株感染的猪肺泡巨噬细胞(PAMs)为抗原,以筛选得到的mAb为一抗,进行Western blot鉴定和间接免疫荧光试验(IFA).使用单抗亚类鉴定试剂盒检测该mAb重链和轻链类型.随后,将p54蛋白逐步截短并与GST标签融合表达后进行Western blot检测,鉴定该mAb识别的抗原表位.[结果]将构建的原核表达质粒pET-21a-E183L(54-183aa)转化至BL21(DE3)感受态细胞中,使用IPTG进行诱导后,p54重组蛋白大部分以可溶的形式在上清中表达,分子量约为17kDa.以纯化得到p54重组蛋白免疫小鼠,三免后7 d的血清效价为1∶409 600,可进行细胞融合,经四次筛选和亚克隆后,获得能够稳定分泌p54蛋白mAb的细胞株,命名为5B11,成功制备腹水并纯化.Western blot和IFA试验结果显示,制备的mAb能够特异性识别HEK293T细胞中表达及ASFV感染PAMs中的p54蛋白.mAb亚类鉴定结果显示重链类型为IgG1型,轻链类型为κ链.该mAb识别的抗原表位序列为80VTPQPGTSKPA90.[结论]利用原核表达体系可溶性表达了 ASFV p54蛋白的第54-183位氨基酸,并以纯化的蛋白为抗原制备了抗p54蛋白的mAb,并对其识别的抗原表位进行鉴定,丰富了 p54蛋白的抗原表位信息,为ASFV血清学检测提供了基木材料.

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