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非洲猪瘟病毒pD345L蛋白单克隆抗体的制备及其表位鉴定

文献类型： 中文期刊

作者： 贺筱萍;张元峰;刘学敏;黄丽;翁长江

作者机构：

关键词： 非洲猪瘟病毒;pD345L蛋白;单克隆抗体;抗原表位

期刊名称：中国农业科学

ISSN： 0578-1752

年卷期： 2025 年 16 期

页码：

收录情况： 北大核心（2023版） ; ; CSCD（2025-2026年度） ; ; 科技核心（2024版） ; ; 农林核心（2024版）

摘要： [目的]制备非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)pD345L蛋白(pD345L)的单克隆抗体(monoclonal antibodies,mAbs),并分析其识别的线性B细胞表位,为探究pD345L在ASFV感染与致病中的功能奠定基础.[方法]构建pET-28a-D345L重组原核表达质粒,将其转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,表达并用亲和层析方法纯化重组的pD345L蛋白(rpD345L).将纯化的rpD345L与等体积的弗氏完全佐剂乳化后免疫5周龄SPF级BALB/c小鼠,每隔两周免疫一次,共免疫 3 次.第二次和第三次免疫均用弗氏不完全佐剂乳化.第三次免疫一周后通过小鼠颌下静脉采血,分离血清,利用ELISA方法检测血清抗体效价,选取抗体效价高的小鼠加强免疫.免疫 3 d 后取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合.将重组GST-pD345L作为包被抗原,利用ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞,经过3次筛选得到能够稳定分泌pD345L mAbs的杂交瘤细胞株,注入小鼠腹腔制备腹水.使用单抗亚类鉴定试剂盒鉴定mAbs的重、轻链类型.利用外源过表达的pD345L和ASFV HLJ/18 株感染的猪肺泡巨噬细胞(PAMs)为抗原,用制备的mAbs作为一抗,分别进行Western blot和间接免疫荧光(IFA)鉴定.随后将截短的 pD345L 与 GST 融合表达,用筛选的 mAbs 鉴定抗原表位,分析鉴定的抗原表位在不同 ASFV毒株中的保守性.[结果]IPTG诱导后,pD345L以包涵体形式表达,分子量为 40.5 kDa.将其免疫BALB/c小鼠后经间接ELISA方法筛选得到 2 株稳定分泌pD345L mAbs的杂交瘤细胞株,命名为 10H3 和 5G1.亚类鉴定结果显示,2 株mAbs重链类型均为IgG1 型,轻链类型为κ链,抗体效价为 1﹕1 638 400.Western blot和IFA结果显示,制备的mAbs均能识别天然表达的pD345L.经Western blot确定抗原表位,结果显示10H3和5G1 mAbs的最小线性B细胞表位分别为 1METFVRLFKD10和 321YEKICCSEES330,这两个抗原表位在ASFV不同毒株中具有保守性.[结论]本研究原核表达并纯化了rpD345L,制备了2株pD345L mAbs,并鉴定了其识别的抗原表位,且这2株mAbs均能有效识别ASFV感染过程中表达的pD345L,为进一步研究ASFV pD345L功能奠定基础.

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