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鸽疱疹病毒荧光定量PCR检测方法的建立和初步应用

文献类型： 中文期刊

作者： 安乐乐;杨宣叶;周海云;宋晓琛;李彦彤;罗迅;赵永清

作者机构：

关键词： 鸽疱疹病毒;DNA聚合酶基因;荧光定量PCR;临床检测;流行病学调查

期刊名称：中国预防兽医学报

ISSN： 1008-0589

年卷期： 2025 年 47 卷 2 期

页码：

收录情况： 北大核心（2023版） ; ; CSCD（2025-2026年度） ; ; 科技核心（2024版） ; ; 农林核心（2024版）

摘要： 为建立可快速、灵敏且特异性检测鸽疱疹病毒(Pi HV)的SYBR Green I荧光定量PCR方法(qPCR),本实验根据GenBank中登录的PiHV DNA聚合酶基因(KJ995972.1)保守区域设计引物,经PCR扩增该基因后连接至pMD19-T载体,构建质粒标准品pMD19-T-PiHV。采用方阵试验对引物终浓度和退火温度优化后,建立检测PiHV的qPCR方法,并用10倍倍比稀释的质粒标准品进行qPCR扩增建立标准曲线。利用建立的该检测方法对鸽圆环病毒(PiCV)、鸽痘病毒(PPV)、鸽腺病毒(PiADV)、鸽轮状病毒(PiRV)、鸽细环病毒(PTTV)核酸和重组质粒pMD19-T-PiHV进行检测,评估该qPCR方法的特异性；利用建立的qPCR和常规PCR分别检测10~0拷贝/μL~10^(8)拷贝/μL的质粒标准品,比较二者的敏感性；以5个浓度质粒标准品作为模板进行组内和组间重复性试验,评估该qPCR方法的重复性；使用该qPCR方法和常规PCR方法对112份疑似Pi HV感染鸽临床组织样品同时检测。标准曲线结果显示,重组质粒标准品在9.47×10^(3)拷贝/μL~9.47×10^(9)拷贝/μL内与其各自的Ct值呈良好的线性关系,相关系数R^(2)=0.9988,扩增效率E=97.7%；特异性试验结果显示,该qPCR方法仅重组质粒pMD19-T-PiHV出现S型扩增曲线,与其他病原核酸均未出现交叉反应,特异性强；敏感性试验结果显示,该qPCR方法对质粒标准品的检测限为9.47拷贝/μL,敏感性是常规PCR方法的100倍；重复性试验结果显示,该qPCR方法组内和组间重复性试验的变异系数均小于1%,重复性好。临床样品检测结果显示,qPCR方法阳性检出率45.54%(51/112),高于常规PCR方法的阳性检出率35.71%(40/112),二者阳性符合率为100%,总符合率为90.18%。本实验在国内首次建立的PiHV qPCR检测方法特异性强、敏感性高和重复性好,可快速高效检测临床样品中的PiHV,为鸽疱疹病毒的临床检测及流行病学调查提供了新的技术手段。

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