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环形泰勒虫重组TA04380蛋白的原核表达及ELISA的建立

文献类型： 中文期刊

作者： 曹天行;刘军龙;张志刚;史康妍;石苗;关贵全;李有全;殷宏;罗建勋

作者机构：

关键词： 环形泰勒虫;TA04380蛋白;原核表达;特异性;ELISA方法

期刊名称：中国寄生虫学与寄生虫病杂志

ISSN： 1000-7423

年卷期： 2022 年

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收录情况： 北大核心（2020版） ; CSCD（2021-2022年度） ; 科技核心（2021版）

摘要： 目的 表达环形泰勒虫的重组TA04380蛋白（rTA04380）并建立酶联免疫吸附试验（ELISA）检测方法,初步评价该方法的应用价值。方法 用TMHMM和SignalP对TA04380蛋白进行生物信息学分析,根据GenBank上公布的环形泰勒虫TA04380核苷酸序列设计引物,PCR扩增TA04380基因的截短片段（1～636 bp）,构建pET30a （+）-TA04380表达质粒,转化至Rosetta （DE3）感受态细胞,诱导表达并纯化rTA04380蛋白,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定蛋白表达情况;蛋白质免疫印迹（Western blotting）分析rTA04380蛋白的反应原性及其与其他牛梨形虫的交叉反应性。以rTA04380蛋白为靶抗原建立检测抗环形泰勒虫抗体的ELISA方法,筛选确定最佳的抗原包被量、血清和二抗的稀释度、孵育时间以及最优的封闭剂;用所建立的ELISA方法检测56份标准环形泰勒虫阴性牛血清和76份标准环形泰勒虫阳性牛血清以确定该检测方法的阈值;分析rTA04380蛋白包被后第1、2、3周ELISA方法的重复性和稳定性;用建立的ELISA检测125份牛血清,并与已报道的基于子孢子表面抗原（SPAG）蛋白的ELISA方法作比较,计算符合率;用建立的ELISA方法检测571份来自9个省（自治区）的牛血清,评价该方法的应用价值。结果 生物信息学分析结果显示,环形泰勒虫TA04380蛋白无信号肽序列,在212～413 aa存在4次跨膜区,与东方泰勒虫同源蛋白的氨基酸序列一致性为55%;PCR扩增片段长636 bp。SDS-PAGE结果显示,rTA04380蛋白主要以包涵体的形式存在,纯化后的rTA04380蛋白相对分子质量（Mr）为31 940;Western blotting分析结果显示,rTA04380蛋白能与抗His的单克隆抗体和环形泰勒虫阳性牛血清反应,与东方泰勒虫、中华泰勒虫、双芽巴贝斯虫、牛巴贝斯虫阳性牛血清和健康牛血清无交叉反应。以rTA04380蛋白为抗原建立的ELISA方法,最佳反应条件为:抗原包被浓度为10μg/ml,1%牛血清白蛋白封闭1 h,1:100稀释的血清孵育1 h,1:6 000稀释的兔抗牛HRP-IgG孵育1 h;检测阈值为16.9%,敏感性和特异性分别为93.4%和96.4%,假阳性率为3.6%。用所建立的ELISA方法与基于SPAG蛋白的ELISA方法检测牛血清样品的阳性率分别是54.4%（68/125）和49.6%（62/125）,符合率为85.6%。用所建立的ELISA方法检测来自9个省（自治区）的571份牛血清样品,总阳性率为43.1%（246/571）,其中阳性率由高到低依次为吉林（85.7%,24/28）、宁夏（54.2%,13/24）、贵州（50.0%,13/26）、河南（8/16）、甘肃（43.8%,57/130）、内蒙古（42.2%,35/83）、辽宁（41.1%,30/73）、云南（38.2%,42/110）和青海（29.6%,24/81）。结论 成功表达了rTA04380蛋白,建立的ELISA方法敏感性、特异性高,稳定性和符合性良好,具有大规模现场应用的潜在价值。

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