文献类型： 中文期刊
作者： 张镇钧;冯婷婷;聂蝉蝉;段祎凡;陈春文;郭若男;高云洁;李梦雨;崔莹莹;党光辉;刘思国
作者机构：
关键词： CRISPR/Cas9;转录因子EB蛋白;自噬;结核分枝杆菌
期刊名称：中国预防兽医学报
ISSN： 1008-0589
年卷期： 2025 年 47 卷 6 期
页码：
收录情况： 北大核心（2023版） ; ; CSCD（2025-2026年度） ; ; 科技核心（2024版） ; ; 农林核心（2024版）
摘要： 转录因子EB(TFEB)作为自噬的主要转录调节因子,通过调控细胞自噬体和溶酶体相关基因的表达影响自噬的发生。为研究TFEB在结核分枝杆菌(MTB)介导细胞自噬中的作用,本实验采用CRISPR/Cas9原理构建重组质粒pSpCas9(BB)-2A-GFP-tfeb,并测序鉴定正确后电转化小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7细胞,简写为WT细胞),经流式细胞仪筛选GFP阳性单克隆细胞,经PCR及western blot鉴定,将鉴定正确的细胞连续传10代,每隔3代均经western blot鉴定。结果显示,经流式细胞术共筛选到25株出现绿色荧光的单克隆细胞,对这些细胞纯化后经PCR鉴定并测序结果显示,仅一株单克隆细胞敲除tfeb中PAM序列(AGG)前的第3位碱基；western blot鉴定结果显示,相比正常细胞,该细胞无57 ku的特异性条带,且每隔3代该细胞均无该57 ku的特异性条带,表明tfeb基因缺失细胞系Δtfeb RAW264.7正确构建,且其遗传稳定性较强。将MTB H37Ra株分别感染WT细胞和Δtfeb RAW264.7细胞,12 h后经western blot检测各组细胞中自噬相关蛋白LC3-II和溶酶体相关膜糖蛋白1(LAMP1)的表达水平,通过RT-qPCR检测自噬相关基因maplc3、ctsb、lamp1、tpp1的转录水平,采用激光共聚焦试验检测TFEB对H37Ra诱导细胞自噬流形成的影响。Western blot和RT-qPCR结果显示,与未感染的两种细胞相比,H37Ra菌株感染的WT细胞中LC3-II和LAMP1蛋白的表达量均极显著升高(P
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